[发明专利]一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法

说明书

本发明提供了一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法，所述纯化方法包括如下步骤：将含有P1‑2A的融合蛋白用3C和TEV蛋白酶进行酶切，以得到酶切液；再将所述酶切液通过镍柱进行镍柱纯化，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体；然后可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒VLPs。本发明的纯化方法纯化后纯度能达到90％以上，得率也在95％以上。

技术领域

本发明涉及一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染的动物疫病，是偶蹄动物的一种急性烈性传染病，该传染病可快速远距离传播。猪、牛、羊等偶蹄类动物易感。国际动物卫生组织(OIE)将该传染病列在法定上报的动物传染病之首，我国也将其排在一类动物传染病的首位。

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的，该病毒属于RNA单链病毒。目前，根据血清型划分共分为：A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3 7个血清型，虽然各型病毒引起的发病症候相同，但各血清型间无交叉免疫，病后康复或免疫动物仍可感染其它血清型病毒而发病。

FMDV呈二十面体对称结构，直径25nm，内含由约8500核苷酸组成的正极性的单链RNA分子。该RNA分子编码的蛋白如图1所示，其中在成熟过程中，蛋白质P1在2A辅助下被蛋白酶3C剪切成称作VP0、VP1和VP3的三个蛋白质。VP0、VP1和VP3的单拷贝形成5S原体，5个拷贝的5S原体随后形成了12S五聚体，12个12S五聚体组装成二十面体对称的75S空衣壳。5S原体形成以后，在RNA包衣壳过程中，VP0裂解成VP4和VP2。但在RNA分子不出现在病毒衣壳内部时，也可以形成病毒衣壳，该病毒空衣壳也可称为口蹄疫病毒样颗粒(VLP)。

目前，传统疫苗都是病毒灭活疫苗，但这些疫苗在口蹄疫的防治中存在着很多不足，主要表现在：难于进行感染动物和免疫动物的鉴别诊断；在疫苗的生产过程中，大量增殖自然病毒，需要严格的防范病毒扩散的设施，但是仍然存在病毒逃逸和病毒灭活不完全而散毒的可能性。

口蹄疫病毒样颗粒(VLP)具有与完整病毒相同的免疫学特性，但不存在散毒的风险，因而利用各种表达系统生产FMDV的空衣壳一直是国内外研究的热点。

在CN109601007B中公开了先用中空纤维柱超滤浓缩含有口蹄疫VLP，然后用梯度蔗糖溶液超速离心纯化得到口蹄疫VLP，或者超滤浓缩液用两次柱层析，第一次用Sepharose 6 FF柱，第二次用CaptoQ ImpRes离子交换层析柱得到纯化的VLP，梯度蔗糖溶液超速离心纯化不利于规模化生产，并且工艺繁琐，另外用两次层析纯化的方法，同样操作过程繁琐，并且蛋白得率也不高。

在CN110777160A中公开了，含有P1-2A的细胞裂解上清液先用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白初步纯化，然后用亲和色谱层析纯化，得到P1-2A，然后3C蛋白酶酶解，得到酶解液在20mM磷酸缓冲液pH8.0、150mM NaCl中透析组装形成口蹄疫病毒样颗粒，然后进行分子筛色谱纯化，分子筛纯化上样量较少，不利于规模化生产。

在CN104404074B中公开了将获得带SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白(VP3，VP1，VP0)样品在4℃酶切12小时后进行下一步的分子筛色谱纯化，分子筛纯化上样量较少，不利于规模化生产。

在CN110981946A中公开了用大肠杆菌表达，镍柱纯化获得带有sumo标签的三种蛋白smtVP0、smtVP3、和smtVP1，然后加入小泛素样修饰蛋白酶进行酶切，再通过用8～20k膜包循环透析组装病毒样颗粒。该方法使用膜包透析的方法，不能够有效去除酶切后的sumo标签及小泛素样修饰蛋白酶，可能对产品质量产生影响。