[发明专利]一种多价适体功能化DNA纳米结构探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种多价适体功能化DNA纳米结构探针，其特征在于，所述探针的DNA纳米结构的一侧具有一条以上的DNA核酸适体，能够与循环肿瘤细胞膜表面蛋白受体特异结合；其另一侧具有一个以上的生物素位点，可结合链霉亲和素修饰的磁性颗粒；所述探针由S1、S2、N1、N2、N3、SYL3C共六条DNA单链合成，其中，

所述S1的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

所述S2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；

所述N1的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

所述N2的DNA序列如SEQ ID NO.4所示；

所述N3的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；

所述SYL3C的DNA序列如SEQ ID NO.6所示；

所述SYL3C含有能够与循环肿瘤细胞膜表面蛋白EpCAM受体特异结合的核酸适体序列；

所述S1为修饰了生物素分子的序列，可结合链霉亲和素修饰的磁性颗粒。

2.权利要求1所述的一种多价适体功能化DNA纳米结构探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1）将终浓度均为10 nM~2 μM的S1、S2、N1、N2、N3共五条DNA单链溶解后，等比例混合在含有5~50 mM Mg²⁺、pH为7.2~8.0的缓冲溶液中，通过高温退火的方式形成长带状纳米结构；

步骤2）向经步骤1）反应后的溶液中，等比例加入终浓度为10 nM~2 μM的适体链SYL3C，等温杂交，即可得到所述多价适体功能化DNA纳米结构探针。

3.根据权利要求2所述的一种多价适体功能化DNA纳米结构探针的制备方法，其特征在于，步骤1）所述高温退火的方式为：温度控制在95℃持续5~10 min，从95℃降温至25℃，降温速度为-0.1℃/10 s，整个退火过程持续2 h以上。

4.根据权利要求2所述的一种多价适体功能化DNA纳米结构探针的制备方法，其特征在于，步骤2）所述等温杂交的温度为25~37℃，时间为2~5 h。

5.一种非疾病诊断和治疗目的的如权利要求1所述的多价适体功能化DNA纳米结构探针在富集循环肿瘤细胞中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述富集循环肿瘤细胞的方法包括以下步骤：

步骤A）循环肿瘤细胞的捕获：循环肿瘤细胞加入DIO染料，细胞染色20~30 min后，离心并重悬于1×PBS中，得到细胞悬浮液；使用胰蛋白酶进行处理1~5 min后，用1×PBS吹打、离心，重悬于含FBS的高糖培养液DMEM中，得到重悬液；将多价适体功能化DNA纳米结构探针加入细胞重悬液中，于4~37℃下静置10~50 min进行细胞捕获，得到样品A；

步骤B）磁分离循环肿瘤细胞：取用1~10 μL 10 mg/mL表面修饰链霉亲和素的磁性颗粒，使用清洗缓冲液进行清洗，至少清洗三次，结束后充分震动，超声5~10 min；将经处理的磁性颗粒加入步骤A）制得的样品A中，于室温下孵育20~60 min；通过磁性颗粒去除上清液后，使用1×PBS溶液清洗至少三次，去除未结合的细胞，得到样品B；

步骤C）荧光显微镜计数及富集效率的计算：将步骤B）制得的样品B再次使用1×PBS重新悬浮，随后通过倒置荧光显微镜对富集后的预先用荧光标记的目标细胞进行荧光成像计数，并计算富集效率。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤A）所述多价适体功能化DNA纳米结构探针的浓度为200 nM。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤A）所述细胞捕获的温度为4℃，时间为40 min。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤B）所述磁性颗粒的直径为0.2~2 μm。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤C）所述富集效率的计算公式为：，其中n为富集细胞数量，N为上样细胞数量。