[发明专利]一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法及应用

权利要求书

1.一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将离体的胎牛皮肤组织预处理后剪碎，用胰酶消化液消化，经过滤、离心后，收集细胞沉淀，将所述的细胞沉淀用10％FBS的DMEM培养基吹散，培养，待细胞贴壁稳定后，更换新鲜培养基，得到原代牛皮肤成纤维细胞；

步骤2：克隆hTERT基因，并构建hTERT基因慢病毒载体，然后将所述hTERT基因慢病毒转导所述原代牛皮肤成纤维细胞，经培养、筛选及鉴定，得到牛皮肤成纤维永生化细胞系。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤1中，所述胎牛皮肤组织预处理包括以下步骤：

在无菌条件下取出胎牛皮肤组织，将新鲜的胎牛皮肤组织样品完全浸泡在75％酒精15-20min，之后使用5×三抗生理盐水浸洗3-5次，然后用2×三抗PBS溶液再次清洗。

3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤1中，采用质量分数为0.125％胰酶消化液消化。

4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤1中，离心条件为：1000rpm/min，离心5min。

5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤2中，克隆hTERT基因的引物为：

hTERT For：5＇－ATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGAGCC－3＇；

hTERT Rev：5＇－GTCCAGGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG－3＇。

6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤2包括以下步骤：

S1：将克隆得到的hTERT基因产物连接到表达质粒pCAGGS和慢病毒穿梭质粒pLV-puro，得到慢病毒包装质粒；

S2：将所述的慢病毒包装质粒与辅助质粒混合后，转导细胞包装慢病毒，培养、过滤，取上清液；

S3：用所述上清液感染原代牛皮肤成纤维细胞，用含有嘌呤霉素的培养基培养，药物筛选3天后，更换一次新的培养基，继续进行药物筛选，经细胞亚克隆后得到稳定表达hTERT基因的牛皮肤成纤维永生化细胞系。

7.根据权利要求6所述的建立方法，其特征在于，S2中，辅助质粒包括VSV-G和pxPAX2，所述慢病毒包装质粒：VSV-G：pxPAX2为2:1:2。

8.根据权利要求6所述的建立方法，其特征在于，S3中嘌呤霉素的浓度为0.5μg/mL。

9.根据权利要求1-8任一项所述的建立方法构建的牛皮肤成纤维永生化细胞系。

10.根据权利要求9所述的牛皮肤成纤维永生化细胞系在构建反刍动物疫病细胞模型中的应用。