[发明专利]具有亚砷酸盐和甲基亚砷酸盐结合能力的蛋白A9、含所述蛋白基因的工程菌株及应用

说明书

本发明提供砷结合蛋白A9、含有该砷结合蛋白A9的编码基因的重组载体和含有上述重组载体的重组工程菌株。本发明的砷结合蛋白A9可提高菌株对亚砷酸盐和甲基亚砷酸盐抗性的应用，提高菌株对亚砷酸盐和甲基亚砷酸盐结合率。本发明的砷结合蛋白A9实现在体外结合亚砷酸盐和甲基亚砷酸盐。本发明的重组工程菌对亚砷酸盐(60μM)和甲基亚砷酸盐(3μM)具有很强的抗性，对亚砷酸盐和甲基亚砷酸盐吸收效率高达89.71％和84.95％、目的蛋白A9对亚砷酸盐和甲基亚砷酸盐吸收效率高达89.08％和88.27％，能够有效去除培养环境中砷。本发明的砷结合蛋白为南方水稻田和水体环境的砷污染修复提供了一种新的生物修复技术。

【技术领域】

本发明涉及遗传工程技术领域，具体涉及一种来源于棘孢木霉的具有亚砷酸盐和甲基亚砷酸盐结合能力的砷结合蛋白，还涉及编码所述蛋白的基因、含有所述基因的载体、重组工程菌株及其应用。

【背景技术】

砷(As)是一种在自然界中广泛存在的类金属，我国土壤砷的背景值为11.2mg·kg^-1，其在土壤中的理化性质和毒性作用与其他重金属相似，被列为土壤八种重金属之一。土壤中常见的砷化物为砷酸盐(AsO₄^3-)、亚砷酸钠(AsO₂^1-)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)。在农田淹水环境中，砷主要以亚砷酸盐(As(III))和还原态有机砷(MMA(II I)、DMA(III))形式存在的。2014年原环保部和原国土资源部发布了全国土壤污染状况调查报告，报告指出我国耕地土壤点位污染物含量超标率达19.4％，其中轻中度污染占超标点位的94.3％，其中类金属砷的超标率为2.7％，污染程度以中、低污染为主。

近年来，砷污染问题的治理逐渐得到人们的关注。有些修复技术如植物修复、钝化、淋洗等修复技术在一定程度上可降低土壤中砷的环境风险，但从长远来看，经济投入大，修复时间长，过度修复等问题会对土壤结构与肥力等造成负面影响，不利于农业发展的可持续性。微生物材料作为一种新型的砷污染修复材料，在新陈代谢的过程中介导砷的累积与转化。如棘孢木霉在课题组先前的研究中发现，通过细胞壁固定和液泡区隔砷，对砷的累积具有显著效果。目前，越来越多的研究证明，环境微生物已经被成功应用于砷污染水体或土壤的修复中，提升效率，降低成本，表现出了很好的发展潜力。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一种新的砷结合蛋白，进一步构建含有该申结合蛋白基因的重组载体和重组工程菌株，通过实验以确定该蛋白表达后对亚砷酸盐和甲基亚砷酸盐具有很好的结合作用，能够有效降低培养环境中的砷含量。

为了实现上述目的，本发明提供砷结合蛋白A9，所述蛋白的编码基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；发明提供砷结合蛋白A9，所述蛋白的编码基因的核酸序列如SEQ IDNO.2所示；

本发明的砷结合蛋白A9来源于棘孢木霉，特别是棘孢木霉Trichodermaasperellum SM-12F1(Arsenite Resistance,Accumulation,andVolatilizationProperties of Trichoderma asperellum SM-12F1,Penicillium janthinellum SM-12F4,and Fusarium oxysporum CZ-8F1,Xibai Zeng et al.)，棘孢木霉Trichodermaasperellum SM-12F1也记载于中国发明专利申请CN 201210361866.6，在该专利申请中写作棘孢木霉菌Trichoderma asperellum，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保存编号为CGMCC No.3186。

基于此，本发明还提供含有上述砷结合蛋白A9的编码基因的重组载体。

以及含有上述重组载体的重组工程菌株，特别优选大肠杆菌。