[发明专利]构建产L-缬氨酸的重组微生物的方法及其所用核酸分子和生物材料

说明书

本发明公开了构建产L‑缬氨酸的重组微生物的方法及其所用核酸分子和生物材料。具体地公开了突变蛋白质CEY17_RS14810^G397Y及其编码基因。本发明构建了包含突变(GG‑TA)的基因工程菌，以及过表达CEY17_RS14810基因或其突变基因的工程菌。实验表明，CEY17_RS14810基因及其变体参与了L‑缬氨酸的生物合成，对CEY17_RS14810基因编码区进行突变或在生产菌中过表达CEY17_RS14810基因和/或其突变体，有助于L‑缬氨酸产量及转化率的提高，可以培育符合工业化生产的高产高质量菌种，对L‑缬氨酸的工业化生产具有重要的意义。

技术领域

本发明属于微生物变异或遗传工程技术领域，具体涉及构建产L-缬氨酸的重组微生物的方法及其所用核酸分子和生物材料。

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为α-氨基异戊酸，是支链氨基酸之一，人和动物自身不能合成。L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，具有促进蛋白合成、抑制蛋白分解的作用，增强机体的免疫防护作用，有助于纠正因手术、创伤、感染等引起的负氮平衡。另外，L-缬氨酸还具有抗中枢疲劳的作用，抗外周疲劳作用，延缓运动性疲劳，加快运动后机体的修复，因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。由L-缬氨酸配制的复合支链氨基酸输液在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合的治疗和肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。L-缬氨酸在食品工业上主要用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基，是新型低分子量凝胶，可以制备形成水凝胶，其在生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域已被广泛应用。

目前，L-缬氨酸的生产方法主要有提取法、化学合成法、发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、收率低，污染严重，难以实现工业化生产。微生物直接发酵法生产L-缬氨酸具有原料来源广泛，成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是一种非常经济、高效的生产方法。而工业发酵中获得高产的菌种，对于L-缬氨酸的发酵生产来说是至关重要的，是整个L-缬氨酸发酵工业的核心，是决定发酵产品工业价值的重要因素。随着基因工程育种技术的不断发展，从分子水平上改造生产菌，研究和挖掘相关基因的功能，为L-缬氨酸的工业化发酵生产提供了广阔的前景。选育高产、稳定的生产菌种，促进L-缬氨酸在微生物体内的积累，进一步提高L-缬氨酸的产量将一直伴随L-缬氨酸发酵工业的发展，对于促进L-缬氨酸产业化的进程具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高微生物L-缬氨酸的产量，所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种构建重组微生物的方法，所述方法包括至少下述任一种：

F1)将编码蛋白质的核酸分子导入目的微生物，得到所述重组微生物，所述蛋白质名称为CEY17_RS14810^G397Y，可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质，

A2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质，

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

F2)将SEQ ID No.1所示的DNA分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F3)利用基因编辑手段(如单碱基基因编辑)对SEQ ID No.1所示的DNA分子进行编辑，使目的微生物中含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。