[发明专利]一种FAdV-4 NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用

说明书

本发明提供一种FAdV‑4 NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用，属于畜牧兽医技术领域。本发明以FAdV‑4 NP株ORF19A基因（GenBank:KU991797.1）作为靶序列设计特异性引物FAdV‑4‑ORF19A F3:5'‑ACCTCAGAACCAACTACTGCTGCTACTAC‑3';FAdV‑4‑ORF19A R3:5'‑ATGAATACGGCAATGATAACACTGAGACAGAC‑3'；并应用于重组酶介导等温核酸扩增（RAA）快速诊断技术。与常规PCR比较，本发明所设计的特异性引物灵敏性好，特异性强，适合畜牧兽医生产一线用于FAdV‑4的诊断。

技术领域

本发明属于畜牧兽医技术领域，具体涉及一种FAdV-4 NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用。

背景技术

禽腺病毒（Fowl adenovirus, FAdV）是腺病毒科腺病毒属的一员。血清4型禽腺病毒（FAdV-4）感染可引起包涵体肝炎-心包积液综合征（hydropericardium hepatitissyndrome, HHS）。1987年在巴基斯坦的安卡拉地区该病被首次报道，因此，又被称为安卡拉病。自2015年夏季开始在我国出现较大范围的爆发。该病的典型病变特征是心脏肿胀、出血，心包内有大量的黄色透明液体或胶冻样渗出物，肝肿大、出血。3～8周龄的鸡感染常突然死亡，初期诊断较为困难，一般无明显的临床症状，通常发病7天后，死亡率逐渐上升。FAdV-4给我国乃至全球的家禽养殖业带来巨大的经济损失，已成为威胁我国养禽业的重大疫病之一。但是目前仍然没有可用于畜牧兽医生产一线的能够快速、准确、简便、灵敏的诊断FAdV-4的技术。

重组酶介导扩增法（Recombinase aided amplification，RAA），其利用DNA聚合酶、重组酶、单链结合蛋白在恒温条件下进行核酸扩增，仅需要在37℃左右反应 30min-60min，即能得到与PCR 相同的结果。该方法弥补了PCR检测需要高温和贵重仪器的缺点，用时少、操作简易，只需一个恒温装置即可。由于不受仪器的限制，可以对大量样品进行快速检测，具有现场快速诊断的优越性。

因此，本发明设计并筛选了一对针对FAdV-4的特异性引物，通过重组酶介导的等温扩增方法建立了一种快速、准确、简便、灵敏的诊断FAdV-4的技术，其与PCR的符合率达100%。

发明内容

本发明的目的在于针对养鸡场现场准确、快速检测FAdV-4难的问题，提供一种FAdV-4 NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用。本发明所建立的RAA诊断技术具有特异性和敏感性好，重复性高，快速、准确等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种FAdV-4 NP株特异性引物，其核酸序列如下：

FAdV-4-ORF19A F3:5'-ACCTCAGAACCAACTACTGCTGCTACTAC-3';

FAdV-4-ORF19A R3:5'-ATGAATACGGCAATGATAACACTGAGACAGAC-3'。

本发明的另一个目的在于提供一种FAdV-4 NP株特异性引物在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用，其应用方法包括以下步骤：

（1）FAdV-4 NP株病毒DNA提取；

（2）RAA反应检测禽腺病毒血清4型：

反应体系： ddH₂O15.5μL，缓冲液25μL，10μmol/L的FAdV-4-ORF19A F3/FAdV-4-ORF19A R3引物各2μL，DNA模板3μL，280mmol/L的乙酸镁2.5μL；所有成分除乙酸镁外全部同时加入预先冻干有SSB 800ng/μL，uvsX 120ng/μL，DNA聚合酶30ng/μL0.2mL的反应管；

反应条件：以上反应体系混合均匀，在35-43℃温度条件下恒温反应30~50min。