[发明专利]一种从土壤中直接筛选拮抗链霉菌的方法

权利要求书

1.一种从土壤中直接筛选拮抗链霉菌的方法，其特征在于：通过土样处理和使用双层培养基的方法，快速高效地从土壤中分离筛选到对植物病原真菌拮抗作用较强的链霉菌，将分离和筛选过程整合为一体，链霉菌的分离采用高氏一号培养基，再加入含植物病原真菌孢子的PDA培养基，链霉菌和病原菌都能正常生长，能够保证真正筛选到拮抗效果好的链霉菌。

2.根据权利要求1所述的一种从土壤中直接筛选拮抗链霉菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.土样处理,将采集的土样风干后过筛，放在冰箱内保存备用；

S2.链霉菌的分离，将制备好的土壤悬液置于高氏一号培养基平板上，培养链霉菌分离平板；

S3.植物病原指示菌的准备，以辣椒根腐病菌尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)为指示菌，将指示菌在PDA培养基平板上25℃黑暗培养7d备用；

S4.拮抗链霉菌的筛选，制备含植物病原指示菌的PDA培养基并加入到链霉菌分离平板上进行拮抗链霉菌的筛选；

S5.拮抗链霉菌的保存，将具有拮抗作用的链霉菌转接至新的高氏一号培养基平板上，28℃黑暗培养7d后保存。

3.根据权利要求2所述的一种从土壤中直接筛选拮抗链霉菌的方法，其特征在于：所述步骤S1中，将采集的土样充分风干，粉碎后过2mm筛子，过筛土样100℃热处理2h后于4℃冰箱保存备用。

4.根据权利要求2所述的一种从土壤中直接筛选拮抗链霉菌的方法，其特征在于：所述的步骤S2中链霉菌的分离方法包括：

S2.1.提前3天制备高氏一号培养基平板，所述高氏一号培养基包括可溶性淀粉20.0g，KNO₃1.0g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，NaCl 0.5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，调节pH至7.2-7.4。

S2.2.土壤悬液的制备,称量5g土样加入盛有50mL无菌蒸馏水的150mL三角瓶中，磁力搅拌10min，使土样充分、均匀地分散，即得10⁰土壤悬液；用1mL微量移液器将10⁰土壤悬液反复吹吸几次后,吸取1mL加入装有9mL无菌蒸馏水的无菌玻璃试管中，再反复吹吸几次，涡旋振荡2min，即得10^-1土壤悬液；同法依次制备10^-2、10^-3、10^-4土壤悬液；

S2.3.链霉菌的分离培养,将10^-3和10^-4土壤悬液分别吸取1mL置于高氏一号培养基平板上，用无菌玻璃珠涂布均匀，每个稀释梯度涂布3个平板；28℃黑暗培养3d，即得链霉菌分离平板。

5.根据权利要求2所述的一种从土壤中直接筛选拮抗链霉菌的方法，其特征在于：所述拮抗链霉菌的筛选方法包括：

S4.1.向步骤S3中培养好的植物病原指示菌平板上加入12mL无菌蒸馏水洗脱孢子得孢子悬浮液；

S4.2.吸取10mL步骤S4.1中得到的孢子悬浮液加入到90mL灭菌并冷却至45℃左右的PDA培养基中，即得含指示植物病原菌的PDA培养基；

S4.3.取5mL步骤S4.2得到的含菌PDA培养基加入到培养3d的链霉菌分离平板上，轻轻摇匀直至PDA铺满整个平板上，25℃黑暗培养3d后观察，菌落周围出现明显抑菌圈的即为目标拮抗链霉菌。