[发明专利]甲酸脱氢酶突变体及其应用

说明书

本申请公开了甲酸脱氢酶突变体及其应用。所述甲酸脱氢酶突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第54位、第121位和第228位中的至少一个氨基酸处的突变。本发明所提供的甲酸脱氢酶相比于常规野生型的甲酸脱氢酶对NMN有更高的还原酶活，其酶活力达到野生型的80～886倍左右，能够高效还原NMN为NMNH，这种高催化活性使其可以以粗酶的形式使用而不需要纯化，或者仅部分纯化之后就可以使用。因而可以大幅降低生产成本，从而适用于大规模工业化生产，更具有市场竞争力。

技术领域

本申请涉及酶工程技术领域，尤其是涉及甲酸脱氢酶突变体及其应用。

背景技术

还原态烟酰胺单核苷酸(Reduced form of Nicotinamide mononucleotide，NMNH)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的前体之一。细胞内NAD+水平的下降，会导致细胞老化和老化相关的疾病，而额外补充NMN和NR可以维持NAD+水平。目前有研究发现，NMNH作为烟酰胺单核苷酸酰基转移酶(NMNAT)的调节因子，相比NMN和NR能更有效地增加NAD+水平，并有效控制细胞新陈代谢速度。因此NMNH成为一种潜在的重要NAD+增强剂。

然而，NMNH作为一种非典型的还原性辅酶因子，除了极少数的黄素还原酶以外，绝大多数的天然氧化还原酶对NMNH催化合成活性极低，导致生产成本过高，市场竞争力较小，严重限制了该产品的应用。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种对NMN有高还原酶活的甲酸脱氢酶突变体及其应用。

本申请的第一方面，提供甲酸脱氢酶突变体，所述突变体包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第54位、第121位和第228位中的至少一个氨基酸处的突变。

在本发明的一些实施方式中，所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第54位突变为天冬酰胺；

所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第121位突变为赖氨酸；

所述如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列在第228位突变为赖氨酸。

在本发明的一些实施方式中，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2～SEQ ID NO.4任一项所示；

在本发明的一些优选实施方式中，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

本申请的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列为(A1)或(A2)：

(A1)编码上述甲酸脱氢酶突变体的核苷酸序列；

(A2)与(A1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在本发明的一些优选实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.8任一项所示。

本申请的第三方面，提供一种载体，所述载体可表达本发明第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体或含有本发明第二方面所述的核酸分子。

在本发明的一些实施方式中，所述载体为pET、pCW、pUC或pPIC9k。

本申请的第四方面，提供一种重组细胞，含有本发明第三方面所述的载体，所述重组细胞非动物或植物新品种。

在本发明的一些实施方式中，所述重组细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的蛋白的真核或原核细胞。

本发明的第五个方面，提供本发明第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体或本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的重组细胞在(B1)或(B2)中的应用：