[发明专利]用于烟草抗青枯病的相斥相分子标记、引物及其筛选方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于烟草抗青枯病的相斥相分子标记、引物及其筛选方法和应用，属于抗青枯病烟草的筛选技术领域。本发明针对烟草抗青枯病提供了两种的相斥相分子标记，分别为烟草基因4370和烟草基因37372的相斥相分子标记；并针对这两个分子标记提供了相应的UTR引物对和SSR引物对。本发明还提供了检测或筛选抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法，利用上述引物对待测烟草品种的基因进行PCR扩增，利用电泳分离技术检测标记，根据是否显示条带，判断待测烟草育种材料或品种是否抗青枯病。上述方法显著提高了抗青枯病烟草品种育种的准确性和鉴别效率，克服了性状表型鉴定困难和常规分子标记对数量性状选择时的低效问题。

技术领域

本发明属于抗青枯病烟草的筛选技术领域，特别是筛选烟草抗青枯病育种材料的相斥相分子标记方法。

背景技术

烟草是卷烟的主要原料作物，也是中国的重要经济作物，而品种是烟叶生产的基础。近年来，由于连作年限的延长，青枯病在烟草上的危害日趋严重，严重降低了烟草产量和品质，已成为烟叶生产的重要制约因素。虽然农业综合防治和化学药剂防治等方法对防治青枯病有一定作用，但实践证明，种植抗青枯病品种是控制青枯病危害的最经济有效的方法。

烟草青枯病是一种由雷尔氏细菌(Ralstoniasolanacearum)寄生引起的细菌性土传病，是威胁世界烟草生产的毁灭性病害。烟草上抗青枯病育种使用的抗原品种主要是TI448A，但TI448A及其衍生烟草品种对青枯病的抗性是由多对加性基因控制的，表现为数量性状遗传特点。传统的个体选择方法是对符合育种目标的农艺性状如高产、优质、抗病等进行直接选择，即选择的是个体表现型而不是基因型。一般而言，这种方法对质量性状的选择是有效的；但对于数量性状的选择，由于存在一因多效、多因一效、调控基因以及修饰基因等的作用，个体的表现型与基因型存在较大差异。因此，通过田间表型性状进行个体选择的准确性较差。尽管传统的育种方法在抗青枯病品种的选育中取得了不少成绩，但由于青枯病病害的复杂性，受环境影响很大，导致抗病品种的选育进展缓慢。

据大量报道，根据抗病性状遗传规律建立的分子标记辅助选择(MAS)技术能减少基因间、环境和基因型互作等影响，可提高筛选效率，加快育种进程。例如中国专利申请CN112410463A提供了一种番茄抗青枯病的分子标记及其应用，其公开了一种用于鉴定番茄抗青枯病基因型，或鉴定番茄抗青枯病品种的SNP分子标记。然而，虽然番茄和烟草同属于茄科植物，但是其具体的品种不同，其发挥抗青枯病的基因型也会存在明显差异。又例如CN113278729B提供了一种烟草青枯病的SNP分子标记、其获得方法及其应用，然而这种SNP分子标记(基因上单个核苷酸变异形成的遗传标记)在电泳前必须进行酶切，将SNP分子可标记转化为可应用的PCR标记，而且对电泳凝胶要求高，一般用PAGE胶才行，操作繁琐，稳定性差，成本高。此外，该标记需要通过条带数量来区分抗病纯合植株、抗病杂合植株和感病纯合植株。

由此可见，目前国内外虽然开发了少量与抗青枯病相关的通常类型的分子标记，但令人遗憾的是，由于烟草青枯病抗性属于数量遗传，这些分子标记与育种辅助选择利用要求相距甚远；至今仅发现了极少量的分子标记能直接应用于烟草抗青枯病品种筛选上。因此，开发出能用于抗青枯病烟草品种选育的分子标记是一项非常迫切的工作。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种用于烟草抗青枯病的相斥相分子标记、引物，以及利用这种相斥相分子或引物，筛选具有抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法。采用该方法既可以鉴别出抗青枯病品种和感青枯病品种，也可以将杂种后代群体中感青枯病植株全部剔除，剩下的即为抗病植株，进而将剩下的植株培育成抗青枯病品种。具体通过以下技术实现。

用于烟草抗青枯病的相斥相分子标记，为烟草基因4370的相斥相分子标记，或烟草基因37372的相斥相分子标记；

烟草基因4370的相斥相分子标记引物扩增的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；烟草基因37372的相斥相分子标记引物扩增的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。