[发明专利]多花黄精微块茎黑暗节能离体繁殖方法

说明书

本发明提供了多花黄精微块茎黑暗节能离体繁殖方法，属于植物组织培养技术领域。该方法通过优化植物生长调节剂和黄精外植体体外培养，降低外植体顶端优势，从休眠状态释放侧芽的生长潜力，诱导块茎形成。细胞学观察发现，莲座型植物外植体可形成多个块茎，每个块茎均起源于叶片基部的腋芽。与不定器官发生不同，新发育的块茎起源于内在侧芽，没有愈伤组织形成。本发明的块茎生产系统提供了一种繁殖多花黄精植物的新方法，有助于更容易地储存、移植和块茎播种。在没有愈伤组织形成的情况下，可以获得更高的遗传稳定性。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及多花黄精微块茎黑暗节能离体繁殖方法。

背景技术

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生宿根草本植物，以根茎入药。作为我国的传统中药，黄精药用历史已有2000多年，具有益气、补肾、补肺、健脾的作用。多花黄精繁殖方法分为根状茎繁殖和种子繁殖。繁殖周期较长，一般5年左右达到收获期。种子发芽时间较长，发芽率为60%-70%，种子寿命为2年，种子繁殖周期较长，一般在5年左右；生产栽培中一般采用根状茎繁殖，即“块茎种子”繁殖，一般于晚秋或早春3月下旬前后选1-2年生健壮、无病虫害的植株根茎进行播种，块茎种子可以提早收获，如3-4年但在田间，根茎繁殖效率低，且易传播土传病害。因此，迫切需要开发一种方便、高效的块茎繁殖方法，该方法通常用于马铃薯，用于黄精的大规模种植。

目前，黄精的组织培养和快繁方法主要是离体组织培养系统，包括外植体消毒、不定芽诱导增殖、生根育苗。例如刘建东等以多花黄精种子萌发的初生根茎为外植体,研究了细胞分裂素不同种类对丛生芽诱导、增殖效率的影响，结果表明一定浓度的6-BA、NAA和IAA组合可有效促进多花黄精丛生芽的诱导和增殖。程强强等人，以多花黄精根茎组织块为材料，研究得出生长素NAA较IBA更有利于不定芽的诱导，TDZ与NAA组合使用不定芽诱导率最高。采用这种方法，黄精组培周期一般为8个月左右，所得到的幼苗块茎少而小，生长能力低，形态和植物结构不规则，移栽后成活率低。不定芽诱导是许多植物离体培养的主要快速繁殖方法。由于不定芽的数量与腋芽的数量无关，其增殖率高于丛生芽发生型，但同时突变率也高于在叶或叶原基的腋基部的顶端或茎的横向位置已发育为原基的固定芽。总之，现有研究只局限于利用不同激素组合对芽体增殖和单个根茎芽生根的培养，所得到的种根茎小，后期种苗的生长速度慢，且变异率无法有效控制，育苗周期至少2年，成本高，无法满足优质黄精种苗的规模化生产。

有关Patatin蛋白家族的研究，自20世纪80年代以来已有许多报道。Patatin蛋白家族属于多基因家族，统称为Patatin like蛋白家族（简称PLP)。Patatin like蛋白家族中各成员之间的结构和功能相似。Patatin最早由Mignery等从马铃薯块茎中分离，鉴定并克隆了块茎贮存蛋白基因patatin，它编码的蛋白质占块茎储藏蛋白的40%。因其表达具有高度的块茎特异性，引起了科学界的广泛关注。Roshal等和Migne等先后对其进行了更进一步的研究分析，认为该基因的表达可以作为块茎发育的生化指标。离体培养试验表明，patatin蛋白基因可以被短日照和高蔗糖浓度等诱导表达，这与试管块茎诱导条件相一致。与自然条件下一样，该基因具有块茎特异性，只在块茎形成的葡甸茎和块茎中表达。已有研究表明，在马铃薯中patatin发生在块茎形态建成早期，与块茎的形成有关，在黄精中Patatin蛋白家族还未有研究。在本发明中，研究了Patatin并将其用于组织培养中块茎形态发生鉴定指标。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种打破顶端优势，促使变异率低的固定腋芽膨大直接形成微块茎组织培养方法，建立了多花黄精微块茎黑暗节能离体繁殖方法，在黑暗条件下该方法的可行性，节约电能的同时，提升黄精快繁效率，促进生产。同时为地下莲作植物多极性生长提供参考。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：