[发明专利]一种负载人重组骨形态发生蛋白rhBMP-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵

说明书

本发明涉及一种负载人重组骨形态发生蛋白rhBMP‑2的壳聚糖/丝素蛋白海绵，由包括人重组骨形态发生蛋白rhBMP‑2、丝素蛋白、壳聚糖、交联剂、以及其他辅料制备得到，其中丝素蛋白和壳聚糖的重量百分比为2：1。本发明一种负载人重组骨形态发生蛋白rhBMP‑2的壳聚糖/丝素蛋白海绵，将壳聚糖和丝素蛋白复合成海绵，并在复合海绵的过程中将rhBMP‑2加入，使得rhBMP‑2在成型后的海绵内均匀分布。利用京尼平和丝素蛋白进行初步交联，再加入改性壳聚糖和辣根氧化物酶，增加获得的海绵的机械应力，以及壳聚糖/丝素蛋白海绵作为rhBMP‑2载体，实现降解和释药时间的巨大进步，同时采用的壳聚糖是烯丙基三甲基氯化铵改性壳聚糖，降低了过敏性。

技术领域

本发明属于含活性蛋白的生物医学材料领域和再生医学领域，具体地，本申请提供了一种负载人重组骨形态发生蛋白rhBMP-2的壳聚糖/丝素蛋白海绵。

背景技术

骨科疾患的治疗通常需要骨移植，作为新骨生长的桥梁，如骨肿瘤、骨不连、颈椎间盘突出、脊柱骨质疏松性骨折、以及众多需要融合手术的脊柱疾患。我国每年有数以万计的病人因创伤、感染、肿瘤等病变引起骨缺损，另有数十万病人行脊柱融合手术，两者均需要骨移植治疗。骨移植存在新增手术创伤、来源受限制、免疫排斥反应、疾病传播和费用昂贵等诸多问题。随着材料科学的发展，以生物材料替代移植骨成为新的发展趋势。理想的骨修复材料不仅要能够主动诱导新骨形成，快速修复骨缺损，还必须有很好的生物相容性和可降解性能，并且必须是安全无毒的。

骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2、BMP2)是促进骨生成的关键因子，属于TGF-α家族成员，BMP2为细胞分化成矿物质沉积成骨细胞的主要信号分子，起到诱导成骨细胞分化的作用。在肢体生长、软骨内骨化、骨折时表达,在骨骼生长发育和再生修复起重要作用，在临床治疗骨伤中具有良好的应用前景。另外由于普通载rhBMP-2的骨修复材料，在产品使用前期往往会集中释放rhBMP-2，不能控制rhBMP-2持续地、微量的释放，导致一段时间内局部组织的rhBMP2含量富集，随血流或组织液流向待修复的组织区域以外的其他组织，可能导致不必要的异位成骨。此外，rhBMP2在体内的半衰期短，局部使用很快就被代谢和吸收，很难发挥作用，即使大剂量持续给药也往往不能提供给靶部位持续有效的浓度，对于需要长时间生长和恢复的骨骼来说无法提供良好的治疗效果，并且容易引起患者成骨质量低、炎症反应以及其他潜在的风险。以上原因提示如何控制其持续、稳定、缓慢地释放，既达到有效促骨生长的作用同时又可以避免和防止不良反应的产生是用好rhBMP2的一项关键技术。

蚕丝作为一种来源充足、成本低、具有强大骨修复潜力的生物材料，也成为近年来关注的焦点。蚕丝主要含丝素蛋白，具备良好的生物相容性和骨诱导性。蚕丝由丝素蛋白和包裹其外的丝胶蛋白两种成分组成。丝胶蛋白是一种亲水性粘性蛋白，约占蚕丝总重量的25％～30％。丝胶蛋白是一种大分子蛋白，由18个氨基酸组成，分子量范围从10kDd～300kDd不等。丝素蛋白与丝胶蛋白一样，也是一种大分子蛋白，由9种氨基酸组成。在丝素蛋白的一级结构中侧链氨基酸组成的疏水结构占主导地位，由β-折叠组成，这种结构使得丝素蛋白有很高的机械强度、柔韧性和弹性。研究发现，丝素蛋白在体内和体外实验中均表现出良好的生物相容性。同时还具备良好的生物相容性、生物降解性以及将炎症反应降到最低。因此，丝素蛋白是一种很好的组织工程支架，尤其是作为骨修改材料，特别是作为骨形态发生蛋白-2(BMP2)的优良载体。在丝素蛋白交联成海绵的过程中却存在交联效率不高以及成海绵后的机械应力不足的问题，而且当初的丝素蛋白支架加载BMP2后，体外释放过快，对于需要长时间生长和恢复的骨骼来说无法提供良好的治疗效果，并且容易引起患者成骨质量低、炎症反应以及其他潜在的风险。

壳聚糖能够为组织生长提供非蛋白质基质并激活巨噬细胞的杀伤活性，并且能够刺激细胞增殖和组织结构形成，而且具备良好的生物相容性、生物降解性等。壳聚糖很容易被制备成水凝胶和海绵等药物载体，且可以延缓BMP2的释放，起到缓释作用，但是作为骨修改材料使用的壳聚糖海绵存在机械应力不足的问题，且容易对人体造成弱过敏反应。