[发明专利]一种重组人溶菌酶提取物及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种重组人溶菌酶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）获取表达重组人溶菌酶的农作物种子；

（2）将步骤（1）中获取的所述农作物种子粉碎，加入pH 7-8的0.03-0.08 mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，放置3-5小时后过滤，留取滤液备用；

（3）将步骤（2）所得的滤液在零下30℃至零下20℃的温度条件下进行冻融循环3-6次，每次间隔20分钟；

（4）对经过步骤（3）处理的滤液在冰水浴的条件下进行超声波处理，超声波处理的条件为400-1000W，时间为10-30分钟；

（5）对经过步骤（4）处理的滤液在0-10℃下高速离心，离心速度为8000-120000 转/分，离心时间为20-30分钟，取上清液；

（6）在步骤（5）所得的上清液中加入氯化镁15 mmol/L、EDTA 2 mmol/L、AEBSF 3.6mmol/L、APMSF 3 mmol/L、PMSF 0.7 mmol/L，调节pH至7.0-7.2，搅拌20分钟后放置5-8小时，然后再加入35%的饱和硫酸铵产生沉淀，3000-5000转/分钟离心，留取上清液；

（7）在上清液中加入724型树脂，按照每升上清液中加入0.3L树脂，静置12-24小时后舍弃液体，保留树脂，用蒸馏水冲洗并控干树脂；

（8）用质量分数为15%的硫酸铵水溶液洗脱树脂，按照每升树脂中加入等体积的硫酸铵溶液，然后在每升洗脱液中加入30克的晶体硫酸铵，在0-5℃的温度下放置12小时，收集沉淀的溶菌酶粗品；

（9）配置溶菌酶精制液：按照5-10g/L的浓度在正己烷中加入三辛基甲基氯化铵，搅拌均匀后按照70-90g/L的浓度加入大豆卵磷脂，调节pH至8.0后按照1g/L的浓度加入辛巴蓝F-3GA以及按照0.05g/L的浓度加入NaCl，放置24小时后使用pH8.0的5mM磷酸缓冲液洗去多余的辛巴蓝F-3GA，静置分层后保留有机层，并在有机层中按照35g/L的浓度加入吐温85，搅拌均匀备用；

（10）精制溶菌酶：在每升步骤（9）制得的溶菌酶精制液中加入100g步骤（8）制得的溶菌酶粗品溶液，在25℃的水浴下保持15分钟，在5000转/分的速度下离心10分钟后保留沉淀，使用包含2M浓度的NaCl且pH为7.3的0.1M磷酸钠溶液冲洗3次，得到高纯度溶菌酶；

其中，步骤（1）中所述的农作物种子为水稻种子。