[发明专利]一种宏基因组来源的耐热耐酸性漆酶及其编码基因

说明书

本发明提供一种从宏基因组中筛选的具有耐热性、耐酸性的漆酶及其编码基因，利用基因重组技术，将漆酶的编码基因异源表达，表征其物理化学性质。本发明所发现的漆酶具有耐热和耐酸的优越特性，在高温、酸碱、有机溶剂等工业条件下具有很大的应用潜力。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种从宏基因组来源的耐热耐酸性漆酶及其编码基因。

背景技术

漆酶（Laccase，EC.1.10.3.2)是一类多铜氧化酶，催化底物范围较广泛，可包括酚类和非酚类物质。漆酶因其绿色催化过程及其唯一绿色副产物“水”而得到研究者们的重点关注。

木质纤维素类生物质废弃物是第二代生产生物燃料的原料，在地球上广泛存在且可再生，其主要成分之一的木质素占木质纤维素类生物质原料干重的15-30%，且含有其中40%左右的能量，是地球上产量最大且可再生的芳香类化合物。漆酶其对木质素具有降解效力已被证实，其催化断裂木质素结构中的C-C键与C-O键，木质素低聚物和芳香性单体产品的生成，同时不破坏纤维素与半纤维素的结构，有利于糖或生物乙醇类生物燃料产量的提高，提高木质纤维素的整体转化水平。

高通量测序和宏基因组学技术能获取大量微生物的功能基因，为挖掘新的性能优异的生物酶而创造了可能性。但从宏基因组学中筛选出来目标酶的基因，还需利用实际的酶催化反应来确认其真实活性和各种物理化学性质，因为目前的技术发展还不能建立基因序列与功能之间的有效性关系。基因重组技术可以实现将一段目的基因插入到质粒中形成含有目的基因的重组质粒，再将重组质粒导入微生物载体如大肠杆菌进行诱导表达，最后分离纯化出目标酶液，再经过特定底物的催化实验鉴定目的酶的活性。

而相比于常温下进行催化反应的酶，耐热性酶更能适应高温（55~90℃）、酸/碱及有机溶剂的工业反应条件，为绿色的工业化应用提供更多的可能，具有更大的工业价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种宏基因组来源的耐热耐酸性漆酶及其编码基因。经过对该基因表达蛋白的化学测试发现该酶有较强的耐热（70℃）和耐酸（pH4.71）性能，能在木质素的生物降解过程及工业化应用中具有很大的潜力。

本发明提出的一种宏基因组来源的耐热耐酸性漆酶，所述漆酶为AA1_Bin30_Lac，漆酶AA1_Bin30_Lac是具有如下（a1）或（a2）特征的蛋白质：

（a1）其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列一致；

（a2）将（a1）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO.1所示的蛋白序列至少90%以上的同源性及至少90%以上的漆酶活性；

其中：SEQ ID NO.1由658个氨基酸残基组成。

本发明提出的一种宏基因组来源的耐热耐酸性漆酶的编码基因，所述漆酶AA1_Bin30_Lac的编码基因从宏基因组中筛选获得；

其中，所述基因具有（b1）-（b3）中任一所述核苷酸序列：

（b1）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

（b2）与（b1）互补的核苷酸序列；

（b3）与（b1）或（b2）互补所示的核苷酸序列具有≥90%一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明提出的一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作性地连接的上述编码基因，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述漆酶的产生。

本发明提出的一种重组表达载体，其包含上述的核酸构建体。所述的载体为原核表达载体如pET系列载体，酵母表达载体或昆虫病毒表达载体BV。

进一步优选为BV系列载体，如Baculovirus / Insect Cells expressionsystem。