[发明专利]一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法

说明书

本发明公开了一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法，本发明通过定点基因重组的方式，将人源补体调节蛋白基因插入到猪ROSA26基因位点，从而构建得到组成型表达人补体调节蛋白的小型猪，构建得到的小型猪不仅避免了外源随机插入造成的遗传背景不清晰和后代繁育过程中因为染色体的分离而造成的表达量不稳定，而且为今后异种移植和免疫相关疾病的研究提供了重要动物资源，具有重要的临床应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法。

背景技术

对于器官功能衰竭的患者，可以通过人工机械装置、干细胞器官再生或器官移植来挽救生命。但是人工机械装置的精密度不高，无法比拟器官的优良性能，胚胎干细胞定向诱导发育为器官的研究，尚未获得突破，所以目前器官移植仍然是治疗器官衰竭病人的优良手段。随着医疗技术的发展，器官移植成为了治疗终末期器官衰竭的有效方法，在临床上得到了广泛应用，但是供体器官短缺的问题也逐渐凸显了出来。据美国器官获取和移植网2018年5月公布的数据显示，器官供求比率不到5%，器官短缺正成为限制器官移植广泛开展的主要障碍。近年来，随着我国糖尿病、慢性肾病、心血管疾病以及肝炎等疾病患者的大幅增长，使得发展成为终末期肝、肾、心等器官衰竭的患者正在逐渐增加，对器官移植需求的压力也将越来越大。器官短缺已成为一个全球性问题，而异种器官移植是目前公认的解决人类器官供体严重不足的有效途径。

异种器官移植是指通过手术的方法将一个物种的器官或组织移植到另一个物种体内，代替原来器官或组织继续发挥功能。目前，异种器官移植研究主要是以猪为供体来源的。相比于其他动物，猪作为异种器官移植的供体有许多优势：猪的生理学、解剖学结构、代谢过程都与人类相似；猪来源广、产仔多、繁殖周期短、生长周期长；猪的器官易获取、无需等待；猪的遗传背景研究清楚，便于进行基因修饰。猪虽然是异种器官移植的优良供体，但从猪到灵长类的异种器官移植中，会发生免疫排斥反应，这也是异种器官移植研究中亟待解决的重要难题之一。敲除α-1,3半乳糖苷转移酶基因（α-1,3-galactosyltransferaseknockout，GTKO）供体猪的制备，虽然在一定程度上解决了异种器官移植超急性免疫排斥反应，但补体介导的排斥反应，仍是机体排斥外源移植物的主要方式之一。高效表达人补体调节蛋白（Human complement regulatory protein，hCRP）基因hCD46、hCD55、hCD59等，能有效地降低异种器官移植的免疫排斥反应。因此，得到高效、稳定、表达不同组合的人补体蛋白的基因编辑猪模型，是进行异种移植和其他免疫相关疾病研究重大而急迫的需求，但是如何制备得到该系列基因编辑猪仍是本领域亟待解决的重要问题之一。

发明内容

鉴于此，为了克服目前本领域存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法，本发明通过定点基因重组的方式，将hCRP基因插入到猪ROSA26基因位点，从而获得的转人源补体调节蛋白基因定点修饰的小型猪，该小型猪可以组成型表达人补体调节蛋白。本发明为今后在猪Rosa26点进行有效编辑提供了有效的gRNA位点，所获得的表达人源补体调节蛋白的动物避免了外源随机插入造成的遗传背景不清晰和后代繁育过程中因为染色体的分离而造成的表达量不稳定，为今后异种移植和免疫相关疾病的研究提供了重要动物资源，具有重要的临床应用价值。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了一种用于有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA。

进一步，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明的第二方面提供了一种靶向猪Rosa26基因内含子1的CRISPR/Cas9系统表达载体。

进一步，所述表达载体由本发明第一方面所述的sgRNA和骨架载体px330构成。