[发明专利]一种猪细小病毒VP2蛋白基因及其应用

说明书

本发明涉及一种猪细小病毒VP2蛋白基因及其应用。本发明用重组表达的猪细小病毒结构蛋白，与佐剂乳化后，制成的疫苗安全性好，抗体效价高，免疫效力高，免疫持续期长，且该疫苗只需单次免疫即可达到理想的免疫效果，具备实际应用价值。

技术领域

本发明属于基因重组疫苗技术领域，具体涉及一种猪细小病毒VP2蛋白基因

背景技术

猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)耐受性极强且具有高度传染性，是导致母猪繁殖障碍的病原之一，猪细小病毒病的临床主要特征是妊娠母猪流产、胎儿死亡和木乃伊化。该病目前呈全球性分布，特别对妊娠母猪和仔猪危害较大，阻碍了猪养殖产业化进程，造成巨大经济损失。PPV是一种较小的无囊膜病毒，该病毒粒子外观呈六角形或圆形，二十面体立体对称，直径介于18-26nm，基因组为单股负链DNA，全长约5000bp。VP2蛋白是构成PPV病毒的主要衣壳蛋白，约占PPV病毒衣壳蛋白总量的80％，由579个氨基酸组成，分子质量为64KU，其携带了主要的抗原决定簇，具有自组装成病毒样颗粒(VLP)的能力，具有良好的反应原性，可诱导动物机体产生免疫反应。

过去的PPV疫苗研制经历了从弱毒苗向灭活苗的发展过程，尽管这些疫苗的使用有效地控制了临床上PPV的感染，但弱毒疫苗存在毒力返强或重组的风险，同时灭活疫苗也存在因病毒灭活不彻底导致的散毒风险，在此情况下研制高效、安全的新型PPV疫苗对有效防控该病具有重要意义。VLPs疫苗由病毒结构蛋白自组装形成，不包含病毒核酸，可介导高效的体液免疫和细胞免疫应答，目前被认为是安全有效的候选疫苗。但目前还没有对免疫动物产生足够保护效力的重组猪细小病毒VP2蛋白疫苗的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪细小病毒VP2蛋白基因片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种重组载体，它包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，它是连接有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的质粒载体；所述质粒载体为pFastBacDual质粒。

本发明还提供了一种表达猪细小病毒VP2蛋白基因的重组细胞，它是包括前述重组载体的大肠杆菌、酵母、昆虫、植物或者哺乳动物细胞中的任一种。

本发明还提供了一种重组猪细小病毒VP2蛋白，它是前述重组细胞表达的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种前述重组猪细小病毒VP2蛋白的制备方法，它包括以下步骤：

1)取前述猪细小病毒VP2蛋白基因片段，与双酶切后的表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组杆状病毒基因-杆粒；

2)将步骤1)所得重组杆状病毒基因-杆粒转染到昆虫细胞中进行病毒包装及重组蛋白表达，收集上清，即得。

进一步地，步骤1)所述表达载体为pFastBacDual质粒载体；所述导入大肠杆菌为导入大肠杆菌TOP10感受态细胞和/或大肠杆菌DH10Bac感受态细胞；和/或，步骤2)所述转染到昆虫细胞为转染到Sf9细胞和/或High Five细胞。

更进一步地，所述导入大肠杆菌为先导入大肠杆菌TOP10感受态细胞，提取表达供体质粒，再将表达供体质粒导入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞；所述转染到昆虫细胞为先转染到Sf9细胞，进行病毒包装及繁毒，再将重组杆状病毒转染到High Five细胞进行重组蛋白表达。

本发明一种重组猪细小病毒VP2蛋白疫苗，它是前述重组猪细小病毒VP2蛋白，经二乙烯亚胺灭活后加入201佐剂乳化制成的疫苗。

进一步地，所述二乙烯亚胺的浓度为0.2％w/w，灭活温度32℃，时间96h，灭活终止加入0.02％w/w硫代硫酸钠。