[发明专利]有水产病原菌拮抗特性的鼠李糖乳杆菌及其制剂的制备及应用

权利要求书

1.一种鼠李糖乳杆菌HT4，分类命名为鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）HT4，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2022年1月5日，分类命名鼠李糖乳杆菌HT4（Lacticaseibacillus rhamnosus）HT4，保藏编号CCTCC NO：M 20211693。

2.权利要求1所述菌株HT4制备具有水产病原菌拮抗特性制剂的方法，其特征在于步骤如下：

（1）菌种活化：

无菌开启鼠李糖乳杆菌HT4的冻干保藏菌种，接种于装有MRS肉汤的试管中，于30～38℃静置培养24～72h，然后转接于MRS肉汤三角瓶中，30～38℃培养活化18～48h；反复活化2～3次，镜检，计数，当菌体浓度10⁸～10⁹CFU/mL时作为种子液；

MRS肉汤培养基组成以g/L计：酪蛋白酶消化物10，牛肉膏粉10，酵母膏粉4，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2，葡萄糖20，吐温-80 1.08，以蒸馏水定容配制，pH 5.7±0.2；

（2）固定化发酵培养：

三角瓶种子培养液制备：将步骤（1）所得种子液以体积比1%～10%接种量接入装有固定化发酵培养基的5L三角瓶，装液量为体积比90%，于30～38℃静置培养24～48h，当菌体浓度达10⁸～10⁹CFU/mL时，作为固定化培养种子液，接入普通好氧发酵罐中进行一级、二级固定化发酵逐级放大扩培，即：5L三角瓶，再200L发酵罐，再2000L发酵罐，甚至更大规模的发酵罐，发酵罐间移种以无菌空气压送方式完成接种；

一级固定化培养：将固定化培养种子液以体积比1%～10%接种量接入200L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70%～90%，无菌空气保持罐压至0.01～0.05Mpa，间歇搅拌，转速50r/min，30～38℃培养20～48h，pH为4.0～5.0时，结束培养，得到一级固定化培养液，其中鼠李糖乳杆菌HT4菌体被吸附固定在海藻酸钙+二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，活菌体浓度≥5×10⁹CFU/mL；

二级固定化培养：将一级固定化培养液用无菌空气压送，以体积比1%～10%接种量接入2000L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70%～90%，无菌空气保持罐压至0.01～0.05Mpa，间歇搅拌，转速50～80r/min，30～38℃培养18～48h，当发酵液pH降至4.0～5.0，培养结束，得到二级固定化培养液，其中鼠李糖乳杆菌HT4菌体被吸附固定在海藻酸钙+二氧化硅形成的凝胶小颗粒中，菌体浓度≥5×10⁹CFU/mL；

固定化发酵培养基组成以g/L计：蛋白胨5～15，酵母膏2～10，葡萄糖10～40，吐温-800～1.0，磷酸氢二钾1～5，柠檬酸三铵0～2，乙酸钠5，硫酸镁0～0.2，硫酸锰0～0.05，碳酸钙5～40，海藻酸钠1～10，二氧化硅1～10，以自来水定容配制，pH 6.0～7.0，121℃灭菌30min；

（3）具有水产病原菌拮抗特性的鼠李糖乳杆菌HT4制剂的制备：

（a）鼠李糖乳杆菌HT4菌粉的制备：将步骤（2）所得二级固定化培养液经高速离心收集湿菌体，湿菌体与脱脂奶粉及淀粉按质量比为：湿菌体:脱脂奶粉:淀粉=1:0.1:2～5进行混合，经20～40℃真空干燥24～48h，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，得到鼠李糖乳杆菌HT4菌粉，菌粉中HT4活菌浓度不低于1×10¹⁰CFU/g；

（b）鼠李糖乳杆菌HT4水剂的制备：将步骤（2）所得二级固定化培养液进行灌装，获得HT4水剂，菌液水剂中HT4活菌浓度不低于5.0×10⁹ CFU/mL；

（c）HT4复合菌剂的制备：制得的鼠李糖乳杆菌HT4菌粉与具有拮抗水产病原菌特性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）AB90008-15、乳酸肠球菌（Enterococcus lactis）JLB-15及酿酒酵母CICC1421进行四菌复配制备鼠李糖乳杆菌HT4复合菌剂，复配质量比为：鼠李糖乳杆菌HT4菌粉:枯草芽孢杆菌AB90008-15菌粉:乳酸肠球菌JLB-15菌粉:酿酒酵母CICC1421菌粉=1：0.1～1：0.1～1：0.01～1。