[发明专利]一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法

权利要求书

1.一种脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，细胞复苏：对脂肪间充质干细胞进行细胞复苏；

步骤二，传代培养：使用传代培养基对脂肪间充质干细胞进行传代培养；

步骤三，分泌因子收获：移除传代培养基，收集上清液，得到脂肪间充质干细胞分泌因子；

上述步骤二中的传代培养基包含以下重量份的原料：干细胞基础培养基400-600ml/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺1-3mmol/L、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸10-20μmol/L、胰岛素2.0-6.0μg/mL 、D-葡萄糖10-20g/L、L-抗坏血酸10-100μmol/L、30-50μg/mL全反式维甲酸、血清蛋白0.3-0.8μg/mL、类胰蛋白酶0.1-0.3μg/mL、人参皂苷10.0-20.0μg/mL。

2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述传代培养基包括干细胞基础培养基460ml/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺2.2mmol/L、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸15μmol/L、胰岛素3.5μg/mL 、D-葡萄糖14g/L、L-抗坏血酸56μmol/L、35μg/mL全反式维甲酸、血清蛋白0.6μg/mL、类胰蛋白酶0.2μg/mL、人参皂苷16μg/mL。

3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述传代培养基中还加入有1-2g/L的混合助剂，所述混合助剂由诱导增强剂和分泌增强剂按质量比为1:（0.2-0.6）组成。

4.根据权利要求3所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述诱导增强剂选用亚硒酸钠、三磷酸腺苷和二甲基甲酰胺中的任意一种或任意多种按任意比的组合物。

5.根据权利要求3所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述分泌增强剂选用亚麻酸、羟基磷脂和脂肪醇聚氧乙烯醚中的任意一种或任意多种按任意比的组合物。

6.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述混合助剂由诱导增强剂和分泌增强剂按质量比为1:0.4组成。

7.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述干细胞基础培养基选用BME培养基、DMEM培养基和MEM培养基中的任意一种。

8.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于：所述步骤一具体包括如下操作：

A1：向离心管中倒入基础培养基8-10mL，预热到35-40℃，静置待用；

A2：将从液氮罐中提取的带有冻存管的脂肪间充质干细胞放入35-40℃水浴锅中，旋盖朝上直立放置，水面不得没过冻存管管盖，摇动冻存管，使冻存液快速融化；

A3：冻存管中的脂肪间充质干细胞融化后，旋开管盖，用移液管吸取脂肪间充质干细胞到操作A1中装有基础培养基的离心管内，并用移液管向转空的冻存管中加入0.8-1mL基础培养基，轻轻震荡冲洗管壁，将冲洗液倒入对应的离心管中，拧紧管盖，颠倒混匀，放入离心机，300g离心5-10min；

A4：用移液管吸弃上清液，旋紧管盖，震散细胞沉淀，旋开管盖，向离心管中加入基础培养基，定容至9-10mL，旋紧管盖，颠倒混匀，放入离心机，300g离心5-10min；

A5：用移液管吸弃上清液，旋紧管盖，震散细胞沉淀，旋开管盖，向离心管中加入溶液C，溶液C的加入量为4-5mL/支，旋紧管盖，颠倒混匀，得到细胞悬液；

A6:用移液管吸取溶液C，按照28-30mL／瓶量加入到T-175培养瓶中，用移液管吸取操作A5中得到的细胞悬液，接种至T-175培养瓶中，细胞接种量为1.0×10⁶-1.2×10⁶／T-175，拧紧瓶盖，晃动均匀，标记编码，标记操作日期将培养瓶放入培养箱中培养68-72h。