[发明专利]一种血浆游离miRNA提取方法及其应用

权利要求书

1.一种从血浆样本中提取miRNA的方法，包括：

(1)准备所述血浆样本；

(2)向所述血浆样本中，加入裂解液和结合液，从而得到第一混合液；

(3)向所述第一混合液中加入无水乙醇，离心，弃上清，从而获得第二混合液；

(4)向所述第二混合液中加入裂解液，再加入无水乙醇，混合，获得第三混合液；

(5)将所述第三混合液转移到硅膜柱中以使miRNA与硅膜柱结合；可选地，一次或多次地向所述硅膜柱中加入清洗液；

(6)加入DEPC水或无核酸酶水至硅胶膜内，将所述miRNA洗脱，以得到所述miRNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述裂解液包含选自Tris-HCl,异硫氰酸胍，EDTA，吐温-20,NP-40的一种或多种成分。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述裂解液包含10-100mM Tris-HCl；优选地，所述裂解液包含约50mM Tris-HCl。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述裂解液包含3-6M异硫氰酸胍；优选地，所述裂解液包含约4M异硫氰酸胍。

5.根据权利要求2至4任一项所述的方法，其中，所述裂解液包含2-10mM EDTA；优选地，所述裂解液包含约5mM EDTA。

6.根据权利要求2至5任一项所述的方法，其中，所述裂解液包含1-5％的吐温-20；优选地，所述裂解液包含约4％的吐温-20。

7.根据权利要求2至6任一项所述的方法，其中，所述裂解液包含2-10％的NP-40；优选地，所述裂解液包含约8％的NP-40。

8.根据权利要求2至7任一项所述的方法，其中，所述裂解液的pH为5.5-7.5；优选地，所述裂解液的pH约为6.0。

9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中，所述结合液包含选自二氧化硅、碳化硅、硅化铁、硅藻土等的一种或者多种物质，和/或盐酸胍。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述结合液包含碳化硅。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述结合液包含浓度为0.1-1g/ml和/或粒径为100nm-25μm的二氧化硅、碳化硅、硅化铁、或硅藻土；优选地，所述浓度约0.6g/ml；优选地，所述粒径为约3μm。

12.根据权利要求9至11任一项所述的方法，其中，所述结合液包含浓度为0.5-2.0M的盐酸胍；优选地，所述浓度为约1M。

13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中，所述步骤(2)中的血浆样本与所述裂解液的体积分数比为1:1至1:4；优选地，所述体积分数比为约1:3。

14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，其中，所述步骤(2)中的血浆样本与所述结合液的体积分数比为1:1至6:4；优选地，所述体积分数比为约2:1。

15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其中，在步骤(3)加入无水乙醇之前，将所述第一混合液在温度T1下静置一段时间t1，所述温度T1为25-70℃，较佳地为25-60℃，更佳地为50-60℃，所述时间t1为1-60min，较佳地为5-30min，更佳地为10-30min。