[发明专利]一种表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌，其特征在于：所述的表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌为携带抗PD1纳米抗体表达质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009及其基因改造菌株，其肿瘤靶向性不发生改变；将抗PD1纳米抗体基因克隆在包含启动子和信号肽的表达质粒上：所述的启动子为J23100组成型启动子或者NirB启动子或者adhE启动子；质粒上含有防止质粒丢失的AT元件。

2.根据权利要求1所述的表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌，其特征在于：所述的信号肽为常规的细菌信号肽，所述的细菌信号肽为sseJ信号肽、MIS信号肽、Flic信号肽、pelB信号肽、SOPE信号肽、SpA信号肽或OmpA信号肽。

3.权利要求1所述的表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌制备的表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌菌剂。

4.根据权利要求3所述的表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌菌剂，其活性成分为如下（a）（b）（c）中的至少一种：

（a）权利要求1所述的表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌的发酵培养物；

（b）权利要求1所得表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌细胞的超声裂解上清；

（c）权利要求1所得表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌细胞的超声裂解沉淀。

5.权利要求1所述的表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）PD1纳米抗体基因的获得；

（2）构建表达PD1纳米抗体的质粒； step1设计同源重组引物；step2 PCR得到DNA片段；Step3 将连接后产物经过化学转化转至大肠杆菌DH5α的化学感受态细胞中；

（3）表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌的构建：将表达质粒电转化至减毒伤寒沙门氏菌VNP20009及其突变菌株，制得表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌。

6.根据权利要求5所述的表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，在pET32a质粒上分别克隆了J23100组成型启动子或者NirB启动子或者adhE启动子，在抗PD1纳米抗体的N端融合有常规的细菌信号肽，质粒上含有防止质粒丢失的AT元件。

7.根据权利要求6所述的表达抗PD1纳米抗体的减毒沙门氏菌重组工程菌的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中，step1设计同源重组引物；step2分别以pET32a(+)-PD1Nb为模板PCR获得目的基因片段，以pTh01为模板PCR获得质粒骨架片段，经过1.2%的琼脂糖凝胶电泳，切出基因产物，用胶回收纯化试剂盒纯化得到DNA片段；通过双片段同源重组试剂盒连接胶回收产物；连接条件为：4-8℃，1-2 hr，或者37℃，30 min；Step3将连接后产物取10 μL经过化学转化转至大肠杆菌DH5α的化学感受态细胞中；转化条件：冰置10 min，42℃热击60s，冰置2 min，加入900 μL无抗性LB液体培养基，37℃震荡培养45 min，5000 rpm离心3min，弃上清，加入1 mL无抗性LB液体培养基混匀，吸取100 μL涂布与带有卡那霉素的抗性平板上，37℃培养箱静置过夜；Step4挑取单克隆至3 mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃震荡培养16 h，用质粒小提试剂盒提取重组质粒；将质粒送去测序公司测序比对，确认正确序列。