[发明专利]一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述多重PCR检测引物组包括以下三组：

(1)用于检测水禽细小病毒的引物组，由GPV-MDPV-F和GPV-MDPV-R组成的引物组，其中：

GPV-MDPV-F的核苷酸序列为：

5’-TGGAAGAAGGCAGTGAGT-3’；

GPV-MDPV-R的核苷酸序列为：

5’-AGGTCCGTAGAGCCATAT-3’；

(2)用于检测鸭肠炎病毒的引物组，由DEV-F和DEV-R组成的引物组，其中：

DEV-F的核苷酸序列为：

5’-CCAAGATACCAGTGATGC-3’；

DEV-R的核苷酸序列为：

5’-ACCTACAATTCAGCAACG-3’；

(3)用于检测鹅星状病毒的引物组，由GAstV-F和GAstV-R组成的引物组，其中：

GAstV-F的核苷酸序列为：

5’-TCATTACGAGCAGGAGAA-3’；

GAstV-R的核苷酸序列为：

5’-CTGCACCGCAACTTTAAA-3’。

2.根据权利要求1所述的水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述用于检测水禽细小病毒的引物组，其检测靶标基因为Rep1基因，引物大小为746bp。

3.根据权利要求1所述的水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述用于检测鸭肠炎病毒的引物组，其检测靶标基因为UL54基因，引物大小为641bp。

4.根据权利要求1所述的水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述用于检测鹅星状病毒的引物组，其检测靶标基因为ORF1a基因，引物大小为460bp。

5.一种根据权利要求1-4任一项所述的水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、质粒标准品的制备及提取

S11、取GPV和MDPV毒株、DEV毒株、GAstV毒株，按照DNA/RNA提取试剂盒说明书提取核酸，RNA样品按试剂盒说明书逆转录合成cDNA第一链备用，利用设计的三组引物，进行PCR扩增；

S12、回收、纯化PCR产物，并连接至pUC57载体，转化后构建pUC-GPV-MDPV、pUC-DEV、pUC-GAstV共三种重组质粒，并将重组质粒菌液送至生工生物工程(南京)股份有限公司测序鉴定；

S13、按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA，采用核酸浓度测定仪测定质粒DNA浓度；

S2、多重PCR方法的建立

S21、多重PCR反应体系：Premix Taq^TM 10μL，上游引物(20μM)1μL，下游引物(20μM)1μL，DNA模板0.5μL，ddH₂O补充至20μL；设置退火温度分别为48℃、49.2℃、51.8℃、53.2℃、56.2℃、58.8℃、60℃；设置GPV-MDPV、GAstV、DEV引物浓度比分别为1:4:5、3:2:3、5:1:1、2:4:5、4:5:2；

S22、通过优化，筛选出多重PCR最适反应条件，其中退火温度为56.2℃；GPV-MDPV、GAstV、DEV引物(20μM)体积比为1:4:5；反应体系为Premix Taq^TM 10μL，每种病毒模板0.5μL，ddH₂O补至20μL。最佳扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56.2℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；72℃终延伸10min。

6.一种根据权利要求5所述的水禽细小病毒、鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括质粒标准品、三组多重PCR检测引物组、PCR试剂及多重PCR反应体系和最适反应条件。