[发明专利]一种细胞迁移双向调控方法

权利要求书

1.一种细胞迁移双向调控方法，其特征在于，使用能产生GHz波段特超声的微纳压电体声波谐振器产生的声流体效应实现金纳米棒的细胞导入，后续二者结合实现对细胞迁移的双向调控。

2.根据权利要求1所述细胞迁移双向调控方法，其特征在于，通过调整所述谐振器的工作时间，对声流体的工作时间进行调整；声流体的合适强度范围应为：保证使生长在盖玻片上的细胞不脱壁，保持正常的生长状态，并且便于使用荧光显微镜的方式对导入细胞的金纳米棒进行观测。

3.根据权利要求1所述细胞迁移双向调控方法，其特征在于，通过调整声流体、金纳米棒、声流体与金纳米棒共同作用、金纳米棒-声流体依次作用的不同作用方法，实现对细胞迁移方向的双向调控。

4.根据权利要求1所述细胞迁移双向调控方法，其特征在于，通过改变谐振器的尺寸，实现不同范围内细胞的金纳米棒导入，或者迁移方向调控。

5.根据权利要求1所述细胞迁移双向调控方法，其特征在于，具体采用如下步骤：利用生物兼容性高的有机聚合物制作腔体，该腔体主要用来盛放液体，并且控制细胞与谐振器之间的距离；

(1)利用生物分子对金纳米棒表面进行修饰，增强金纳米棒的生物兼容性；

(2)将细胞稀释至0.5×10⁵—1×10⁵浓度，培养在盖玻片表面，盖玻片放入培养皿中，并在所有样品中加入相同体积的完全培养基，之后放入培养箱中培养至细胞完全贴壁；

(3)将样品培养皿中的完全培养基吸去，并用磷酸缓冲液对细胞进行冲洗；

调整谐振器工作时间，重复进行以下实验筛选使金纳米棒大量进入细胞并且不会影响细胞活性的条件为最优条件：

(4)将腔体放置于器件上方，并且中心对齐；在腔体中加满金纳米棒溶液，之后将培养有细胞的载玻片放置在腔体上方，细胞与谐振器相对，并且轻轻按压，使载玻片与腔体紧密结合没有缝隙，同时保证腔体内没有气泡；

(5)打开信号发生器，谐振器会即刻作用产生声流体；声流体受到腔体上方盖玻片阻碍时会产生速度突变，进而有剪切力产生，作用于细胞；

(6)经过持续设置时间的声流体刺激后，对作用后的细胞利用显微镜观察、拍照，对得到的细胞图片进行金纳米棒发光分析，利用发光强度对导入的金纳米棒量对比，挑选不会对观察产生影响的导入时间；

(7)观察完毕后，将细胞放入培养箱中继续培养两天；

(8)结合(6)和(7)中细胞观察及细胞生长状态，确定最优的金纳米棒导入时间；

在确定了金纳米棒导入时间之后，利用划痕实验对细胞在不同作用方法下的迁移能力进行评估；划痕实验是一种简捷的测定细胞迁移运动和修复类似体外伤口愈合的模型，利用微量枪头或硬物在培养的单层贴壁细胞中心区域划线，以去除中央部分的细胞，然后继续培养至实验设定时间后取出，观察周边细胞的迁移能力；

(9)重复上述1—3的实验步骤；

(10)完成细胞准备之后，对细胞进行不同的方式刺激：

A.声流体刺激：重复上述步骤4—5；尤其的，在步骤(4)的操作过程中，将腔体内的金纳米棒溶液换为完全培养基；在声流体对细胞持续刺激至设定时间后，使用微量枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；

B.金纳米棒(与细胞共孵育导入)：重复上述步骤4—5；尤其的，在步骤(5)的操作过程中，信号发生器不开启，没有声流体产生；在使用金纳米棒与细胞共孵育至设定时间后，使用微量枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；

C.声流体与金纳米棒共同作用：重复上述步骤4—5；在声流体与金纳米棒共同作用至设定时间后，使用微量枪头对细胞中心区域划痕，再将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；

D.金纳米棒(与细胞共孵育导入)-声流体依次作用：首先重复上述操作B，培养24小时之后，利用显微镜对细胞的生长情况进行观察拍照；之后重复上述操作A，特别地，在步骤A的操作过程中，要将谐振器对准划痕处细胞刺激至设定时间，并且不需要进行划痕步骤。完成以上操作用，将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照；

E.没有任何刺激：使用微量枪头对细胞生长中心区域划痕，之后将细胞放入培养箱中继续培养，每隔24小时利用显微镜对其生长情况进行观察拍照。