[发明专利]一种淀粉样变性药物药效定量评价方法

说明书

本发明公开了一种淀粉样变性药物药效定量评价方法,首先，血样在体外添加不同药物或溶剂对照，同时加入双免疫标记TTR蛋白以启动解离与重聚反应；然后特定时间加入特异性荧光小分子探针终止其反应，并对TTR蛋白进行荧光共价修饰；最后采用超高效液相色谱‑荧光检测技术进行检测，通过比较血样中内源性TTR四聚体蛋白的动力学稳定性从而评价不同药物的抗淀粉样变性作用。本发明的方法无需对血样进行酸或尿素变性处理，可直接原位定量血样中TTR四聚体蛋白的动力学稳定性，且检测时间更短，更方便快捷。

技术领域

本发明属于药效学评价领域，涉及利用超高效液相色谱法-荧光检测技术检测血样中内源性TTR四聚体蛋白的动力学稳定性，用于评价药物在预防和/或治疗淀粉样变性疾病中的药效。

技术背景

淀粉样变性(amyloidosis)是指由人体器官和周围神经中淀粉样蛋白堆积引起的疾病。这些蛋白质沉积会导致器官功能异常。在各种形式的淀粉样变性中，转甲状腺素蛋白淀粉样变性(transthyretin amyloidosis，ATTR)是一种罕见的进展性、致命性疾病，其特征是错误折叠的转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)组成的淀粉样沉积在人体器官和组织中的异常堆积。ATTR可影响身体的许多器官和组织，包括周围神经系统以及心脏、肾脏、胃肠道和眼睛等器官。在临床上，转甲状腺素蛋白淀粉样变性心肌病(ATTR-CM)和转甲状腺素蛋白淀粉样变性多发性神经病(ATTR-PN)是该疾病的两种表现形式。

在对ATTR发病机制进行全面研究的基础上，目前已确定天然TTR四聚体的解离是TTR聚集级联或过程中的初始和限速步骤。当编码TTR蛋白的基因发生突变或机体处于衰老状态时，四聚体TTR蛋白的稳定性下降，并解离为二聚体，然后又快速解离为单体，呈现出部分展开的构象，并自组装成有毒的非原纤维聚集体，最终变成淀粉样蛋白原纤维。TTR淀粉样变性长期存在巨大未满足的医疗需求，其发病率和死亡率较高，可导致全球约50000人死亡。诊断后中位生存期为4.7年，患有心肌病的患者的生存期仅3.4年。而对于已确诊的患者来讲，治疗选择一般以所受影响的器官为基础，但治疗选择很有限，而且往往不能阻碍疾病的进展。

TTR，也被称为前白蛋白(prealbumin，PA)，是一种在血液中转运全视黄醇结合蛋白的四聚体蛋白，同时也是血液中甲状腺素(T4)的次要载体。在机体中，大多数T4由血液中的白蛋白或甲状腺结合球蛋白转运，这使得TTR上的大多数T4结合位点处于空缺状态。与此同时，结合ATTR发病的核心机制，研究人员将药物研发的重点放在了限速四聚体解离前阻断TTR聚集上，即设计了TTR小分子“动力学稳定剂”的概念，也就是小分子配体结合天然TTR四聚体，以显著减缓四聚体解离，并阻止疾病进展。动力学稳定剂氯苯唑酸(tafamidis，商品名为)，是经监管机构批准的全球首个用于ATTR-PN的药物，也是全球首个、唯一经批准用于治疗ATTR-CM的药物，填补了此前中国在ATTR治疗领域无有效药物的空白。目前，另外两种TTR动力学稳定剂：候选药物Acoramidis(AG10)和非甾体类抗炎药二氟尼柳(diflunisal)，也显示出具有治疗TTR淀粉样变性的潜力。有报告表明，作为TTR动力学稳定剂，AG10在人血液中对结合和稳定TTR更有效、且更具选择性，其作用优于氯苯唑酸。此外，也有文献报道，一些天然产物，如大豆中的主要异黄酮产物——染料木素(genistein)，同样也具有稳定TTR四聚体的潜能。因此，准确的评价药物的药效不仅能确保用药效果，同时也利于新药开发。