[发明专利]一种适用于高通量靶向基因组甲基化检测的文库构建方法及其试剂盒在审
| 申请号： | 202210190373.4 | 申请日： | 2022-02-28 |
| 公开（公告）号： | CN114774514A | 公开（公告）日： | 2022-07-22 |
| 发明（设计）人： | 娄加陶;王琳;郭志伟;余佳佳;杨国华 | 申请（专利权）人： | 上海羿鸣生物科技有限公司;羿鸣（苏州）诊断技术有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06 |
| 代理公司： | 上海申新律师事务所 31272 | 代理人： | 郎祺 |
| 地址： | 201318 上海市浦东新区*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 适用于 通量 靶向 基因组 甲基化 检测 文库 构建 方法 及其 试剂盒 | ||
1.一种适用于高通量靶向基因组甲基化检测的文库构建方法，其特征在于，步骤包括：
S1、将片段化DNA中非甲基化的C碱基转化为U碱基；
S2、通过若干线性扩增引物对包括靶向区域的步骤S1转化后的片段化DNA进行线性扩增；
S3、在步骤S2线性扩增后的产物中加入连接酶以及接头；
S4、对步骤S3连接后的产物进行PCR扩增，即得DNA测序文库分子；
其中，所述线性扩增引物包括：第一通用序列和特异性靶向序列，所述线性扩增所采用的酶组合物包括：至少一种具有3’-5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶和/或至少一种不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶；所述接头包括：第二通用序列；所述PCR扩增所采用的引物特异性结合所述第一通用序列以及所述第二通用序列。
2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述将片段化DNA中非甲基化的C碱基转化为U碱基的方法包括：亚硫酸氢盐转化法或酶转化法。
3.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述线性扩增引物如SEQ IDNO.11-20中的至少一种所示。
4.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述至少一种具有3’-5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶包括：Apo-Enchant Polymerase I、PlatinumTMSuperFiTM DNAPolymerase、KOD OneTM PCR Master Mix或KOD-MuLtiEpi-TM中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的文库构建方法，其特征在于，所述至少一种具有3’-5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶包括：Apo-Enchant Polymerase I和/或KOD-MuLtiEpi-TM。
6.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述至少一种不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶包括：rTth DNA Polymerase或rTaq DNA Polymerase中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的文库构建方法，其特征在于，所述至少一种不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶包括：rTth DNA Polymerase。
8.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述线性扩增所采用的酶组合物包括：Apo-Enchant Polymerase I和rTth DNA Polymerase。
9.根据权利要求7所述的文库构建方法，其特征在于，所述线性扩增所采用的酶组合物包括：Apo-Enchant Polymerase I、KOD-MuLtiEpi-TM和rTth DNA Polymerase。
10.一种适用于如权利要求1-9任一项所述文库构建方法的试剂盒，其特征在于，包括：线性扩增引物、线性扩增酶组合物、连接酶、接头以及PCR扩增引物。
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