[发明专利]一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法

权利要求书

1.一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

S1：取新生儿脐带血，加入淋巴细胞分离液，离心，吸取白膜层，洗涤，获得脐带血间充质干细胞，将脐带血间充质干细胞进行传代培养；

S2：取新生儿脐带血，加入红细胞裂解液进行裂解，裂解液经密度梯度离心，获得脐带血淋巴细胞，将脐带血淋巴细胞进行培养；

S3：将所述脐带血间充质干细胞与所述脐带血淋巴细胞分别转移至共培养装置中，加入空白培养基进行共培养；

S4：对患者进行血液提取，采用血细胞分离器提取患者的淋巴细胞，采用外循环系统，使患者的淋巴细胞在共培养装置内循环驯养；

S5：采用抗体对淋巴细胞进行活化，促进淋巴细胞增殖；

S6：将循环一定时间后的淋巴细胞重新输回患者体内，提取共培养装置内的细胞因子进行冻干，得到成品。

2.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于：步骤S3中，将所述脐带血间充质干细胞与脐带血淋巴细胞分别采用培养基洗吹三次，离心，采用培养基进行吹打获得重悬细胞，转移至共培养装置中培养24-48h。

3.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于：步骤S6中，制备细胞因子冻干粉包括如下步骤：

将空白培养基加入S3所述的共培养装置中，24h-48h后收取脐带血淋巴细胞培养上清液；在4℃，2000g的条件下离心30min，弃去沉淀，得到培养上清液；

将所述培养上清液与外泌体提取液以体积比2:1进行混合，在4℃条件下孵育过夜，得到孵育液，将孵育液在4℃，10000g的条件下离心60min，吸取底部沉淀，获得含外泌体的浓缩液；

将浓缩液用PBS缓冲液进行溶解，得到外泌体盐溶液，将所述外泌体盐溶液进行冻干，得到细胞因子冻干粉。

4.根据权利要求3所述的一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述冻干温度为-80℃，冻干12h。

5.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述血液与淋巴细胞分离后重新输送至患者体内。

6.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于：步骤S5中，抗体为白细胞介素2或抗CD3抗体的一种。

7.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述淋巴细胞分离液为羟乙基淀粉与泛影葡胺溶于蒸馏水中高压灭毒后制成。

8.根据权利要求7所述的一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述羟乙基淀粉与泛影葡胺的质量比为2:3-3:2。

9.根据权利要求1所述的一种脐带血淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述红细胞裂解液为质量分数0.8％的氯化铵溶液，所述氯化铵溶液为氯化铵溶解于PBS缓冲液，并经过高压灭毒后制成。