[发明专利]ADAD2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用

说明书

本发明涉及一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对，所述遗传标记的核苷酸序列是ADAD2基因的序列，所述序列的突变位点选自c.C981G、p.F327L、c.1283‑1GA中的一个或多个。本发明还提供了检测试剂盒在诊断非梗阻性无精子症的应用。以及ADAD2基因在制备检测非梗阻性无精子症诊断试剂盒中的应用。本发明提供了ADAD2基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行非梗阻性无精子症基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行ADAD2基因突变位点的快速检测。

技术领域

本发明属于医学基因诊断领域，涉及遗传病非梗阻性无精子症的致病基因ADAD2突变位点及其在基因诊断中的应用。

背景技术

非梗阻性无精子症(NOA)通常被认为是男性不育的一个非医学可控制的原因。这些患者占所有不育男性的10％，他们的无精子症的原因是精子发生异常。以卵胞浆内单精子注射(ICSI)为标准治疗方式的体外受精技术的建立，使这些男性中的许多人通过手术从睾丸中取出精子成功地养育了一个孩子。

双脱氧链终止法即Sanger测序：反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)、双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、测序引物及DNA聚合酶等。测序反应的核心就是其使用的ddNTP：由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。

早期基于Sanger法的测序设置了四个平行的测序反应，每一个反应中分别包括目标片段、DNA聚合酶、测序引物、四种dNTP和一种特定类型荧光(或放射性同位素)标记的ddNTP(即不同的反应中分别为ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP)。通过这样的配置，在不同的反应中DNA链将会分别在A、G、C及T位中止，并形成不同长度的DNA片断。这些片断随后可被凝胶电泳分开并显示出来。变性丙烯酰胺电泳有四个泳道，每个泳道对应一种碱基。电泳结束后通过放射自显影或紫外显影可读出X光片或凝胶影像。图像中的每一个暗带表示一个双脱氧核苷酸(ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP)掺入后链终止的DNA片段的结果。四个泳道之间的不同暗带的相对位置可以用来读取(从底部到顶部)DNA序列，从而得到该目标片断的碱基排列顺序。随着Sanger测序技术的发展，ddNTP的标记技术有了很大的提高。不同种类的ddNTP可以被不同荧光基团所标记，而这些荧光基团具有相同的激发波长和不同的发射波长，因而在光学上表现为不同的颜色。因此，测序反应可以在一个体系中进行，满足了业界对测序速度、自动化及通量不断提高的要求。

Sanger操作简便，因此被广泛使用，在其基础上衍生出荧光自动测序技术等。基于荧光标记和双脱氧链终止法的荧光自动测序仪被广泛使用，用于人类基因组计划等项目。基于毛细管电泳技术，Sanger测序现在已经可以在高度自动化的测序仪中进行，商用的产品包括Life Technologies的3130xL、3730xL、3500Dx与3500Dx xL测序仪及Beckman的GeXP遗传分析系统等。这类系统最长可测定600-1000bp的DNA片段，且对重复序列和多聚序列的处理较好，序列准确性高。

中国专利文献CN 105112501 A,公开了一种非梗阻性无精子症的检测试剂盒，包括检测与非梗阻性无精子症相关的遗传标记的引物对，遗传标记的核苷酸序列是DAX-1基因的序列，所述序列的突变位点选自c.152GA、c.312CG、c.725CT、c.766GC、c.1153GT、c.1279AG和c.162GA中的一个或多个；所述引物对选自primer 1、primer 2、primer 3或primer 4引物对。通过大规模测序在非梗阻性无精子症病人中筛选出了DAX-1基因7个新的突变位点，研究表明DAX-1的上述突变可能导致非梗阻性无精子症的发生，从而能够通过使用本发明的试剂盒检测该突变来实现对男性不育症(尤其是非梗阻性无精子症)的诊断检测。