[发明专利]石龙芮体细胞胚介导的遗传转化方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法。本发明可快速、高效诱导出石龙芮体细胞胚结构，可以通过“外植体侵染‑体细胞胚诱导”方法成功转化外源基因，所建立的石龙芮体细胞胚介导的遗传转化体系具有快速、高效、嵌合率低、可稳定遗传等特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及石龙芮体细胞胚介导的遗传转化方法。

背景技术

石龙芮是一种毛茛科中草药，富含药用价值较高的次生代谢物，包括生物碱、单宁、黄酮类化合物、异黄酮和原儿茶醛。长期以来，石龙芮一直被中国传统医学用来防止乙型肝炎病毒HBV和单纯疱疹病毒1型HSV-1的复制，其还可用于治疗黄疸、风湿性疼痛、哮喘和小便失禁。同时，石龙芮也是控制黑腹果蝇和赤拟谷盗等害虫非常有效的杀虫剂。此外，石龙芮具有较强的污水处理能力，能吸收大量氮、磷，积累和监测土壤中重金属的含量变化，如铜、铅、铁、锌等。

现有技术对毛茛科植物的研究多集中于该科植物的次生代谢物质的活性检测、毒性与活性成分组分分析，土壤重金属与有机污染物的清除与净化，以及二倍体黑种草、耧斗菜等观赏性毛茛科植物花器官的发育机制等方面。多种毛茛科植物的常规无菌苗培养过程尚且存在一些技术难度，如种子萌发率、发芽势的同步率、无菌苗的继代培养等。关于毛茛科植物体细胞胚发生及其介导的高效再生、常规再生体系以及遗传转化体系均无可参考的现行体系。石龙芮体细胞胚介导的高效再生与遗传转化等体系建立存在诸多技术瓶颈：如培养基筛选、种子催芽、植物生长调节剂种类与浓度筛选、最佳外植体的筛选以及农杆菌侵染时段的选择等。因此，石龙芮体细胞胚介导的高效再生与遗传转化体系方面未有研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法。

根据本发明具体实施方式的石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将石龙芮种子消毒，播于MS培养基中，进行无菌苗培养，其中MS培养基包括以下组分：MS盐、B5有机、30g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，MS培养基的pH为5.8；

(2)选择无菌苗的营养器官为外植体，在转化侵染介质中进行农杆菌转化介质侵染；

(3)将侵染后的外植体平铺于共培养培养基中进行共培养；

(4)将共培养后的外植体转入含有抗生素的体细胞胚诱导培养基中进行体细胞胚的诱导发生以及抗性体细胞胚的筛选，其中，体细胞胚诱导培养基包括以下组分：MS盐、B5有机、10.0mg/LNAA、30g/L蔗糖、3.6g/L结冷胶，体细胞胚诱导培养基的pH为5.8；

(5)将抗性体细胞胚置于生根培养基中，于光照条件下诱导胚体生根，其中，生根培养基包括以下组分：1/2MS盐、1/2B5有机、0.1mg/LNAA、15g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，生根培养基的pH为5.8；

(6)炼苗、移栽。

根据本发明具体实施方式的石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法，步骤(2)中，转化侵染介质包括以下组分：MS盐、B5有机、15g/L葡萄糖，转化侵染介质的pH为5.8。

根据本发明具体实施方式的石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法，步骤(3)中，共培养培养基包括以下组分：MS盐、B5有机、40mg/L乙酰丁香酮、30g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，共培养培养基的pH为5.8。

根据本发明具体实施方式的石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法，步骤(4)中，体细胞胚诱导培养基含有100mg/L硫酸卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素钠。

根据本发明具体实施方式的石龙芮体细胞胚介导遗传转化的方法，步骤(5)中，将抗性体细胞胚置于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m^-2s^-1条件下诱导生根。