[发明专利]一种少突胶质细胞的制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种少突胶质细胞的制备方法及应用。提供的方案以显著短于为先前方案所需的75‑95天的时间重演少突胶质细胞分化的主要步骤。通过大麻素受体激动剂WIN55212‑2诱导NSC分化，促进OLIG2+OPC诱导。WIN衍生的OLIG2+祖细胞分化为PDGFRα+OPCs，具有高度迁移性，并且可以进一步分化为具有强大髓鞘化能力的成熟OL。将WIN衍生的OPC移植到病变部位时，脊髓损伤（SCI）小鼠的运动能力从移植后第2周开始显著改善。免疫染色结果表明，WIN衍生的OPC可以分化为成熟的OL，使受损的轴突髓鞘化。本发明的方法及产品在细胞治疗领域具有广泛的应用，尤其对于脊髓损伤具有显著的治疗效果。

技术领域

本发明属于干细胞治疗领域，具体涉及一种少突胶质细胞的制备方法及应用。

背景技术

人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)可由人体皮肤、血液等体细胞在体外重编程而来，且具有和人胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)类似的无限增殖能力，及在体外分化为几乎所有功能细胞，包括神经干细胞（neural stem cell,NSCs）的能力。iPSC这一特性成功地绕开了伦理性问题，在干细胞治疗方面具有广泛的应用。

少突胶质细胞(Oligodendrocyte，OL)是存在于脊椎动物中的中枢神经系统细胞。它们产生富含脂质的层状髓鞘，其覆盖神经元轴突并产生限定的电绝缘区段以使动作电位传导速度最大化。髓磷脂对于轴突完整性和存活也是重要的，并且已显示即使影响少突胶质细胞代谢的小变化也可导致神经退化。

动物实验表明，移植的少突胶质细胞前体细胞（Oligodendrocyte precursorcells，OPC）可促进白质存留，增加内源性少突胶质细胞数量，减小空腔容积，从而提高运动恢复。OPC其潜在的治疗机制可能是，再髓鞘化，调节局部免疫微环境，分泌神经营养因子，提供物理支架以支撑生长的轴突。OPC可以分泌一系列物质，包括生长因子，神经营养因子，趋化因子与细胞因子。

脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是一种导致局部神经缺损或脱髓鞘的毁灭性疾病。然而，由内源性少突胶质细胞前体细胞（OPCs）介导的髓鞘再生过程是不够的。因此，外源OPC的移植被认为是SCI模型中实现髓鞘再生的有效方法。然而，目前产生OPC的方法大多是耗时的或基于慢病毒技术，存在低效率或安全问题。

WIN55212-2是一种CB受体激动剂，在大鼠神经性疼痛模型中被发现是一种强效的镇痛剂。它通过受体介导的信号传递激活p42和p44 MAP激酶。

发明内容

本发明的第一个方面提供了一种制备OLIG2+神经干细胞（NSC）的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）生成PAX6+/NESTIN+/SOX2+的NSC：从第0天到第7天，将PSC用神经诱导培养基培养，并每天更换培养基；优选地，PSC汇合率为70-90%；

（2）从第8天开始，每天将培养基更换为含有视黄酸（RA）、Purmorphamine（Pur）和CB受体激动剂的新鲜N2培养基，培养4-5天；

优选地，第12天时，OLIG2+神经干细胞至少达到90%；更为优选地，第12天时，OLIG2+神经干细胞至少达到95%。

本发明的第二个方面提供了一种制备少突胶质细胞前体细胞（OPC）的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）生成PAX6+/NESTIN+/SOX2+的NSC：从第0天到第7天，将PSC用神经诱导培养基培养，并每天更换培养基；优选地，PSC细胞密度为70-90%；

（2）从第8天开始，每天将培养基更换为含有RA、Pur和CB受体激动剂的新鲜N2培养基；