[发明专利]一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体及其应用

权利要求书

1.一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构为scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN；

其中，X包括肿瘤靶向抗体或能与肿瘤特异结合的配体、受体；

Y为共刺激受体的胞内区，所述共刺激受体选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、CD226；

M为gamma chain家族细胞因子受体的胞内区，所述细胞因子受体选自IL2Ra、IL2Rb、IL4Ra、IL7Ra、IL9Ra、IL15Ra、IL21Ra；

N为IL2Rg胞内区。

2.根据权利要求1所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述X选自anti-CD19抗体、anti-CD20抗体、EGFR抗体、HER2抗体、EGFRVIII抗体、anti-PSMA抗体、anti-BCMA抗体、anti-CD22抗体、anti-CD30抗体。

3.根据权利要求1所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述X为anti-CD20抗体，所述Y为4-1BB胞内区，所述M选自IL2Rb胞内区、IL4Ra胞内区、IL7Ra胞内区、IL9Ra胞内区、IL21Ra胞内区中的一种。

4.根据权利要求3所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述scFv(X)-(Y)CD3zeta为scFv-antihCD20-20BBZ，其序列如SEQ ID No.1所示；所述IL7Ra胞内区的序列如SEQ ID No.2所示；所述IL2Rb胞内区的序列如SEQ ID No.3所示；所述IL4Ra胞内区的序列如SEQ ID No.4所示；所述IL9Ra胞内区的序列如SEQ ID No.5所示；所述IL21Ra胞内区的序列如SEQ ID No.6所示；所述IL2Rg胞内区的序列如SEQ ID No.7所示。

5.一种由如权利要求1～4中任一项所述的嵌合抗原受体的重组表达载体构建的CAR-T细胞。

6.一种如权利要求5所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、慢病毒载体的构建及病毒生产；

将scFv(X)-(Y)CD3zeta，M和N形成编码融合蛋白的基因，两端加入慢病毒载体，并和慢病毒包装质粒共同转染，获得scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN病毒；

步骤二、scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN CAR-T细胞的制备；

分离纯化后的人PBMC经过培养后，感染步骤一获得的scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN病毒，在合适的条件下进行细胞扩增，制备scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN CAR-T细胞。

7.根据权利要求6所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒载体的构建及病毒生产的具体步骤包括：

将scFv(X)-(Y)CD3zeta，M和N通过overlap PCR形成编码融合蛋白的基因，两端加入酶切位点克隆慢病毒载体；将测序正确的克隆无内毒素大提，和慢病毒包装质粒共同转染，预定时间后收取上清，过滤、离心浓缩病毒，获得scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN病毒。

8.根据权利要求6所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN CAR-T细胞的制备的具体步骤包括：将人PBMC经过分离纯化后，接种到具有合适刺激条件的培养板，培养预定时间后，感染步骤一生产的scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN病毒，按照合适的刺激条件进行细胞扩增，经过2轮刺激扩增后，获得的细胞即为scFv(X)-(Y)CD3zeta-MN CAR-T细胞。

9.一种含有如权利要求5所述的CAR-T细胞的制剂。