[发明专利]一种河豚毒素的非诊断目的检测方法

说明书

本发明公开了一种河豚毒素的非诊断目的的检测方法，其用得到的氨基酸序列如SEQID NO:1、3、5、7、9或11所示模拟表位肽的噬菌体建立了灵敏、快速的竞争型酶联免疫分析法；该方法ICsubgt;50/subgt;为9.8ng/mL，检测范围为3.4～52.8ng/mL。与传统的基于半抗原的免疫分析方法灵敏度相比，本方法更加灵敏；该方法对其他海洋毒素的交叉反应良好。

技术领域

本发明涉及河豚毒素检测技术领域，具体地，涉及一种河豚毒素的非诊断目的检测方法。

背景技术

河豚毒素是一种毒性很强的非蛋白类神经毒素，该毒素作用于中枢及周围神经系统，选择性的与细胞膜表面的钠离子通道上的蛋白质结合，从而阻断钠离子通道，直接影响神经肌肉兴奋性的传导，使得神经肌肉呈麻痹状态，甚至引起死亡。河豚毒素不仅是一种毒性很强的海洋毒素，且其性质非常稳定，一般的烹饪手段难以破坏，这就造成了很多河豚毒素中毒的事件，使得河豚毒素的检测变得尤为重要。除此之外，河豚毒素在医学方面也有很重要的应用价值，它可以作为很好的镇痛和麻醉药物，还可以作为戒毒和抗心律失调的药物等。河豚毒素的检测对于毒素的提取和鉴定也有重要的意义。

目前河豚毒素的的检测方法主要是理化分析和免疫化学法，但这两种方法都有一定的局限性，其中一点就是必须要用到河豚毒素的标品来作为竞争性抗原、标准或竞争性示踪剂。目前国际上河豚毒素标准品的价格不菲，而且属于生物制剂遭到国际禁运，此外，河豚毒素本身就是一种剧毒，对于实验室以及实验室的操作人员本身就是一种安全隐患。因此，建立一种无毒的检测方法，能够很大程度上缓解毒素标品的稀少而带来的检测压力，同时可以降低实验室人员中毒的风险。

噬菌体展示技术可以将随机编码的目的基因插入丝状噬菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示，这样就形成了一个以噬菌体为载体的肽库。再利用蛋白质之间的特异性结合的作用，从肽库里面分离出能和某抗体结合的特定的噬菌体，为该抗体的模拟表位，即一种能够与抗体特异性结合并通过模拟抗原表位与被分析物竞争结合位点的短肽。无毒检测的方法就是利用从噬菌体肽库里面筛出来的模拟表位来代替毒素和抗体相互作用，从而提供一种环境友好、无毒的分析方法。该方法筛选方便省时省力，成本低廉，性质稳定，最重要的是可降低实验人员的暴露有毒环境的风险。在有毒有害物质的免疫检测领域，模拟表位代替抗原进行免疫分析具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种河豚毒素的非诊断目的检测方法。

本发明的第一个目的是提供一种河豚毒素模拟表位肽。

本发明的第二个目的是提供一种编码河豚毒素模拟表位肽的基因。

本发明的第三个目的是提供一种质粒。

本发明的第四个目的是提供一种重组微生物。

本发明的第五个目的是提供一种噬菌体

本发明的第六个目的是提供一种河豚毒素的非诊断目的检测方法。

本发明的第七个目的是提供所述的河豚毒素模拟表位肽、所述的基因、所述质粒、所述重组微生物、所述噬菌体中的一种或几种在建立河豚毒素的非诊断目的检测和/或河豚毒素的检测试剂盒中的应用。

本发明的第八个目的是提供一种河豚毒素的检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

(1)将纯化的河豚毒素单克隆抗体包被在高吸附酶标板上，用3％牛血清白蛋白封闭酶标板，随后将随机环七肽噬菌体展示库加入酶标板中进行淘筛，按照结合-洗脱-扩增的淘选方案进行，通过3轮的富集淘筛。其中，三轮淘筛包被的抗体用量和用于竞争洗脱噬菌体的河豚毒素标品的用量依次减少；

(2)经过3轮淘筛后，随机挑选40个噬菌体单克隆进行噬菌体ELISA的初步鉴定，对于得到的12个阳性克隆进行扩增，测序共发现6种序列。