[发明专利]一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测引物、探针及应用

说明书

本发明公开了一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR检测引物、探针及应用。属于生物检测技术领域。包括：引物NB‑F‑4716、NB‑R‑4949和探针NBV‑TZ。本发明最佳上下游引物浓度均为500nmol/L，探针浓度为400nmol/L，在1×10⁸～1×10¹copies/μL之间呈现良好的线性关系，线性相关系数R²＝0.996，扩增效率为105.9％；特异性较强，敏感性较高，对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10¹copies/μL，重复性较好，组内变异系数和组间变异系数均小于3％；为BNeV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测引物、探针及应用。

背景技术

纽布病毒(Nebovirus，NeV)是杯状病毒科、纽布病毒属的唯一成员，同科的病毒还有诺如病毒属(Norovirus)、札幌病毒属(Sapovirus)、水疱疹病毒属(Vesivirus)、兔病毒属(Lagovirus)。

NeV为无囊膜单股正链RNA病毒，基因组全长约为7.4kb，由两个开放的阅读框(ORFs)组成，分为三种基因型：NB、NA1和DijonA216。纽布病毒的易感动物只有牛，可诱发犊牛厌食症和木糖吸收不良，尽管目前尚无NeV的分离培养体系，但在排除了其他病毒的含NeV腹泻粪便无菌处理后感染新生无菌小牛，可引起严重腹泻和肠道损伤，尤其在十二指肠和空肠最为严重。

目前已在美国、英国、巴西以及我国犊牛粪样检测出了BNeV，其分子生物学检测方法有SYBR Green荧光定量RT-PCR检测方法、TB Green荧光定量RT-PCR检测方法，巢氏RT-PCR检测方法、常规RT-PCR检测方法，尚未见TaqMan荧光定量RT-PCR检测牛纽布病毒的报道。

因此，如何提供一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测引物及检测方法、体系，提供更为准确的结果是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测引物、探针及应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测引物，包括：引物NB-F-4716，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；引物NB-R-4949，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的：还包括探针NBV-TZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了含有上述引物的试剂或试剂盒。

本发明还提供了一种非诊断治疗目的使用TaqMan荧光定量RT-PCR检测牛纽布病毒的方法，使用上述的引物。

优选的包括扩增体系：GoTaq Probe qPCRMaster Mix 10μL，ScriptTMRT-MIX for1-Step RT-qPCR 2×0.4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，10μmol/L探针0.8μL，cDNA模板2μL，余量RNase-Free ddH2O，总体积为20μL。

优选的：包括扩增程序：45℃反转录15min；95℃预变性2min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共45个循环。