[发明专利]一种用于制备环状RNA的载体及其应用

说明书

本发明提供了一种用于制备环状RNA的载体及其应用。本发明首先提供一种用于制备环状RNA的载体，其包含能够转录为环状RNA前体分子的DNA序列，所述环状RNA前体分子的3’端带有多聚A尾。本发明的带有多聚A尾的环状RNA前体分子进行体外环化得到环状RNA的过程中Rnase R的处理时间缩短，降低了环状RNA的损失，在提高环状RNA的富集效率的同时提高产物的纯度；并且所述体外环化后的RNA分子在转染到真核细胞中时细胞毒性降低。本发明亦提供了上述用于制备环状RNA载体的制备方法，以及提供了所述环状RNA前体分子的制备方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及提供一种用于制备环状RNA的载体及其应用。

背景技术

环状RNA(circular RNA,circRNA)与传统的线性RNA(linear RNA)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，不易降解，表达更稳定。Wesselhoeft,R.A.等曾报道基于I型自剪切内含子设计的高效RNA环化工具，其使用的环化载体包含了柯萨奇病毒的IRES元件(CVB3 IRES)、Gaussia荧光素酶(GLuc)和Anabaena pre-tRNA的I型内含子，将Anabaena pre-tRNA的I型内含子拆分后设计在待环化序列的两侧。在GTP和镁离子存在的条件下，环状RNA前体分子能通过双酯交换反应实现自动环化，但是在生成环状RNA的过程中也会产生大量的副产物，例如未成环的环状RNA前体分子以及被剪切下来的内含子片段等。目前，主流的富集纯化环状RNA的方法是利用Rnase R进行处理，但Rnase R在性质上不稳定，不同批次酶的差异性大，易导致环状RNA纯化富集效果不稳定；而且Rnase R不仅能消化线性RNA，还能消化部分环状RNA，导致环状RNA纯化富集过程中部分环状RNA的丢失。因此，对于纯化富集环状RNA，需要尽量缩短Rnase R的处理时间以减少环状RNA的损失，在提高环状RNA的富集效率的同时提高产物的纯度，最终在转染细胞时降低其带来的细胞毒性。

M.Puttaraju等在Group I permuted intron-exon(PIE)sequences self-spliceto produce circular exon中报道了通过I型内含子的设计实现环状RNA的制备，WO2019236673A1记载了一种用于在真核细胞中翻译的环状RNA，并对制备此种环状RNA使用的载体进行了描述，能够实现环状RNA的制备，但均无法解决上述纯化富集环状RNA的同时缩短Rnase R处理时间、提高环状RNA的富集效率、降低细胞毒性的问题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于制备环状RNA的载体。

本发明的另一目的在于提供一种环状RNA前体分子。

本发明的另一目的在于提供所述环状RNA前体分子的制备方法。

本发明的另一目的在于提供所述载体在制备环状RNA中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种环状RNA的制备方法。

本发明通过在载体中设计可以转录为环状RNA前体分子多聚A尾的DNA序列，完成引入多聚A尾的环状RNA前体分子的制备，可在制备环状RNA过程中，解决环状RNA富集效率、环状RNA产物纯度和/或转染细胞后带来的细胞毒性等问题。

具体而言，一方面，本发明提供了一种用于制备环状RNA的载体，其包含能够转录为环状RNA前体分子的DNA序列，所述环状RNA前体分子的3’端带有多聚A尾。