[发明专利]埃格特氏菌(Eggerthella lenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种埃格特氏菌(Eggerthellalenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒。本发明利用埃格特氏菌的特异性引物对埃格特氏菌进行检测，实现了对疑似类风湿关节炎患者进行粪便样本检测。特异性好，本发明根据16S RNA基因序列设计引物，高特异性与目的基因结合。本发明对于埃格特氏菌高表达的RA诊断与临床治疗具有较高的参考价值，适于推广应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种埃格特氏菌(Eggerthellalenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒。

背景技术

迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)是一种专性厌氧革兰阳性杆菌，生长缓慢，5d内可形成肉眼可见菌落，1935年科学家埃格特首次从人类粪便中分离出该菌，最初归类在厌氧杆菌属中，1999年完成测序后细分为埃格特菌属。

类风湿关节炎又称类风湿(Rheumatoid arthritis,RA)，是发病机制还没有完全明确的一种慢性的、对称性的、全身性的、炎症性的自身免疫性疾病，目前RA已成为危害人类健康的重要疾病之一，RA病因复杂、变化多样，现研究证明RA被认为与细菌感染密切相关，前期研究证明RA患者的肠道菌群失衡，并发现埃格特氏菌、牙龈卟啉单胞菌、拟杆菌等显著表达失衡。RA与骨关节炎(osteoarthritis,OA)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、反应性关节炎等疾病症状有相似性，因此建立一种更加快速鉴别诊断RA的方法，对临床上确诊及治疗有积极指导意义。

RA自身抗体的检查是目前主要诊断检查方法一般包括：患者关节液培养、关节滑膜活检、类风湿因子检测、抗CCP抗体检测、抗核抗体，这些方法虽有利于RA的诊断和治疗，但检查操作繁琐、判断指标复杂，而利用埃格特氏菌在RA患者肠道的富集开发的埃格特氏菌检测试剂盒，便成为了一种快速有效的诊断方法。

前期本研究通过三代宏基因组学检测类风湿关节炎患者(未给药半年以上，且为初次诊断为类风湿关节炎患者的粪便样本)6例，用二代宏基因组学检测类风湿关节炎患者(未给药半年以上，且为初次诊断为类风湿关节炎患者的粪便样本)76例均检测出埃格特氏菌全长DNA序列，而在健康人的粪便中是没有的。同时本研究在类风湿关节炎患者的关节腔的滑膜液中用16SrDNA测序方法也检测到Eggerthella lenta DNA片段，申请人认为Eggerthella lenta同时存在肠道和关节滑膜液中这正是类风湿关节炎“菌-肠-关节轴”致病新机制的发现所在，突破肠壁屏障，进入血液的通路，游离到关节从而加速关节病变的发生。我们预测可以针对Eggerthella lenta的特异性，采用菌群移植，口服益生菌等手段，实现对类风湿关节炎的早期治疗和预防。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种埃格特氏菌的特异性引物；

本发明的再一目的是提供一种埃格特氏菌的特异性检测方法；

本发明的再一目的是提供用于诊断RA的检测试剂盒。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明根据埃格特氏菌的线粒体DNA序列，设计一对特异性引物，该引物只对埃格特氏菌具有扩增能力，该引物的核苷酸序列如下所示：

正向引物：Elen-F：(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)；

反向引物：Elen-R：(5′-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3′)。

根据本发明的特异性引物进行埃格特氏菌的检测方法包括如下步骤：

(1)目的DNA的提取：从粪便或滑膜液样本中提取肠道微生物DNA；

(2)利用所述的特异性引物对所述目标DNA进行扩增，得到扩增产物；

(3)对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。