[发明专利]大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体及其构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌‑铜绿假单胞菌穿梭表达载体及其构建方法，其中大肠杆菌‑铜绿假单胞菌穿梭表达载体包括：抗性筛选基因，复制蛋白基因和表达区片段；所述表达区片段包括：启动子、RBS序列、多克隆位点、噬菌体λ的转录终止子Tsubgt;0/subgt;序列；所述启动子（含RBS序列）及终止子Tsubgt;0/subgt;序列前后带有酶切位点，可通过简单的酶切、连接反应快速实现不同启动子或终止子元件的更换，步骤简单，极大地缩短了更换载体表达元件的时间，满足多样化、高通量的克隆需求。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体及其构建方法。

背景技术

鼠李糖脂(Rhamnolipids)是一类糖脂类的生物表面活性剂，其结构由亲水基团和疏水基团两部分构成，其中亲水基团由1-2分子鼠李糖基组成，疏水基团由1-2个β-羟基脂肪酸单元组成。与传统的化学表面活性剂相比，鼠李糖脂不但具有更优异的表面活性和稳定性，还具有无毒、无污染、能生物降解、生物相容性好、良好的抗菌活性和促进伤口愈合等优点，从而在生物医药、食品、化妆品、农业、石油开采以及环境污染修复等众多领域展示了其独特的应用前景。随着社会的发展和人们环保意识的增强，生物表面活性剂将有更加广阔的前景，有望成为化学合成表面活性剂的替代品。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)体内含有合成鼠李糖脂的完整代谢途径，也是目前用于合成鼠李糖脂最多的宿主。然而，目前鼠李糖脂的合成存在发酵产量低和分离成本高的问题，限制了它的工业化应用。大多数的研究，采用基因工程改造和发酵工艺优化(如培养条件、培养基成分、过程控制等)两种途径提升鼠李糖脂产量。发酵工艺优化虽然能够显著提升鼠李糖脂的产量，但转化效率、发酵底物选择、产物类型等重要生产指标仍受菌种遗传的背景限制。因此，利用基因工程开发更高效的鼠李糖脂合成菌株受到了越来越多的关注。

在一定范围内，细胞工厂产量与关键合成酶的表达量直接相关，通过基因表达层面的优化提高合成酶的表达量是提高鼠李糖脂产量的一种有效策略。鼠李糖脂合成基因的过表达需要有载体的参与，但目前广泛适用于大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体仅有pAK1900。大多数研究采用克隆完整的鼠李糖基转移酶操纵子基因(rhlAB)，并将其连接到穿梭克隆载体的方法，实现基因的过表达。然而，该方法存在天然启动子受到rhlR和rhlI等全局转录因子调控的问题，使得鼠李糖脂的产量提升并不理想。此外，Zhao等通过重叠延伸PCR技术将oprL基因的组成型启动子与rhlAB基因连接，获得pBBRPoprAB表达载体；Xie等利用Red/ET DNA重组技术将3种不同强度的组成型启动子(P_apra、P_tac和P_rhaB)替换rhlAB基因的原始启动子，获得相应的表达载体。上述两种表达载体的构建方法步骤繁琐，更换启动子需要进行多次PCR，这不仅增加了PCR过程中引入突变的风险，也提高了克隆成本，降低了克隆的成功率，无法满足多样化、高通量的克隆需求。构建适用于铜绿假单胞菌的穿梭表达载体对于快速实现靶基因的过表达，提高鼠李糖脂的产量是至关重要的。

因此基于上述技术问题需要设计一种新的大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体及其构建方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体及其构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭表达载体，包括：

抗性筛选基因，复制蛋白基因和表达区片段；

所述表达区片段包括：启动子、多克隆位点、噬菌体λ的转录终止子T₀序列；

所述启动子及终止子T₀序列前后带有酶切位点，以及

所述启动子包括RBS序列。