[发明专利]一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法

说明书

本发明公开了一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，步骤如下：蚯蚓肠道内容物的快速获取；胞外基因组内标基因的构建与制备；蚯蚓肠道内容物胞外DNA的提取。本发明方法一方面可以将个体细小的赤子爱胜蚓的肠道内容物快速取出，步骤简单、耗时短；另一个方面还可以将肠道内容物中的胞外eDNA进行有效分离与提纯，提取效果稳定可靠、重复性好，提取效率可达到61%。通过核酸蛋白测定仪检测，提取的eDNA的OD260/OD280可以达到1.63，OD260/OD230达到1.72，可以进行后续的分子操作。本发明提取方法大大提高了蚯蚓肠道内容物的提取质量，为后续蚯蚓肠道胞外遗传物质的研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物技术科学技术领域，尤其是一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法。

背景技术

蚯蚓转化是畜禽粪污高值、高效资源化利用的一种新兴技术，该技术不仅处理效率高，而且可以变废为宝、实现绿色环保，日益受到人们重视。然而，由于在养殖过程中低剂量抗生素的长期使用，已导致畜禽粪便中出现大量抗生素抗性细菌（Antibioticresistance bacteria, ARB）和抗生素耐药基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs），且当前污染形势十分严峻。如果不加以处理，畜禽粪污中的ARGs可能随着蚯蚓转化过程富集到蚯蚓体内或者残留在蚯蚓粪，进一步加大ARGs 进入食物链的风险，最终威胁人类健康和生命安全。

本申请人前期研究中发现蚯蚓可以一定程度降低粪污中大部分ARGs的含量水平，且蚯蚓肠道是ARGs 消解的重要场所，其中，蚯蚓肠道的独特微生物群落在此过程中也扮演着重要的角色。微生物细胞是ARGs的主要携带者，当微生物细胞自然死亡或因环境改变发生水解死亡后，细胞内DNA包含胞内ARGs在内的遗传物质即会被释放出发来，形成有利于胞外的DNA和ARGs即eDNA与eARGs，且eARGs会通过不同于iDNA的传播方式对细菌耐药性扩散起到一定的作用。因此，针对不同转化时期蚯蚓的不同肠段进行肠道内容物的快速获取及其胞外eDNA的高效提取的进一步探究，对于摸清蚯蚓肠道消解ARGs的关键部位及其消解机理的研究尤为重要。

目前，蚯蚓肠道内容物的获取主要是采用蚯蚓解剖的方法，但该方法主要是适用于个体较大的威廉环毛蚓，且该方法比较耗时，肠道内容物还容易受到体液的污染，而对于个体较细小的赤子爱胜蚓肠道内容的快速获取方法，目前还缺乏相应的快速提取方法；此外，对于不同样品中eDNA的提取方法主要有苯酚-氯仿抽提法、磁珠吸附法CTAB提取法等，但这些方法主要针对组织、血浆和养殖粪水中eDNA的提取。而蚯蚓肠道内容物复杂，蚯蚓体液干扰严重，现有方法无法直接用于蚯蚓肠道中eDNA的提取，因此建立一种蚯蚓肠道内容物快速获取及其eDNA的高效提取方法至关重要。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一种蚯蚓肠道微生物总DNA的提取方法（CN105821036A），该提取方法一方面以蚯蚓新鲜粪便为样品，并对样品进行前处理，一方面将蛋白酶K(消化)与土壤DNA提取试剂盒联用，从而使本发明提取方法解决了现有方法无法克服泥沙干扰，造成的蚯蚓肠道微生物总DNA提取效率低的问题；本发明提取方法大大提高了蚯蚓肠道微生物总DNA的提取效率和提取质量，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到的总DNA条带明亮清晰，从而能够更加准确全面反应蚯蚓肠道内微生物的状况，为后续微生物群落结构与功能的研究奠定了基础。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种高效提取蚯蚓肠道内容物及其胞外DNA的方法，步骤如下：