[发明专利]一种巴斯德毕赤酵母不同碳源下的内参基因及其引物和应用

说明书

本发明公开了一种巴斯德毕赤酵母不同碳源下的内参基因及其引物和应用，所述内参基因为Eif5a基因和/或RPL14B基因。本发明提供的内参基因在巴斯德毕赤酵母不同碳源培养基中稳定表达，为蛋白生产过程中相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据；弥补了巴斯德毕赤酵母实时荧光定量内参基因的缺失，有利于菌株构建工程和重组蛋白生产，为今后开展基因表达研究提供了可靠依据。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及到一种巴斯德毕赤酵母不同碳源下的内参基因及其引物和应用。

背景技术

巴斯德毕赤酵母是一种单细胞真核微生物，同时也是一种甲醇酵母，被广泛用于生产重组蛋白的宿主，近年来作为生产化学品的细胞工厂备受关注，具有严格调控的表达系统，与酿酒酵母相比糖基化更少，在基础培养基中也可以实现高密度发酵，生长速度快，具有真核的翻译后修饰机制，可以正确的表达、分泌外源蛋白。在重组巴斯德毕赤酵母的构建过程中经常需要检测基因的表达水平。

目前，实时荧光定量(Reverse transcription quantitative polymerase chainreα-tubion，RT-qPCR)是最常用于检测基因转录水平的方法，但它依赖于合适的内参基因对功能基因的相对表达定量进行数据标准化。内参基因必须在特定的实验条件下满足稳定表达的要求。以往的研究表明，没有一种单一的内参基因可以用于归一化所有的实验条件或者物种。迄今为止，ACT1基因是仅有的在巴斯德毕赤酵母中广泛应用于实时荧光定量的内参基因。在海滨雀稗中对MT2a,PIP1,VP1,和Cor413等基因的表达模式用实时荧光定量进行检测。结果表明，使用稳定的和不稳定的内参基因进行归一化会导致目的基因的表达水平存在显著差异，这会引起实验结果的误解。

巴斯德毕赤酵母用于构建细胞工厂时，需要检测不同碳源培养基中目的基因的转录情况，目前，还没有巴斯德毕赤酵母在不同碳源培养基中表达量稳定的内参基因的研究报道，这不利于使用实时荧光定量方法研究重组巴斯德毕赤酵母中功能基因的表达情况。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

本发明的其中一个目的是提供一种巴斯德毕赤酵母不同碳源下的内参基因，所述实时荧光定量内参基因在巴斯德毕赤酵母不同碳源培养基中稳定表达，为蛋白生产过程中相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种巴斯德毕赤酵母不同碳源下的内参基因，所述内参基因为RPL14B基因和/或Eif5a基因。

作为本发明所述内参基因的一种优选方案，其中：所述RPL14B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明所述内参基因的一种优选方案，其中：所述Eif5a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的是提供用于扩增所述的内参基因的引物，包括扩增RPL14B基因用引物和/或扩增Eif5a基因用引物。

作为本发明所述引物的一种优选方案，其中：用于扩增RPL14B基因的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。

作为本发明所述引物的一种优选方案，其中：用于扩增Eif5a基因的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物。

本发明的另一个目的是提供利用所述的引物扩增巴斯德毕赤酵母不同碳源下的内参基因的扩增方法，包括，