[发明专利]非抗体依赖的泛素化修饰富集方法和检测方法

权利要求书

1.一种蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、从待检测生物样品中提取获得全蛋白质样品；

S2、利用化学修饰方法对释放出来的全蛋白质样品中自由氨基进行封闭，得底物蛋白；

S3、对封闭后的底物蛋白进行泛素链水解：底物蛋白中加入去泛素化家族酶，，进行酶切，得到泛素化位点修饰处赖氨酸的ε氨基暴露的S3样品；优选地，所述去泛素化家族酶包括USP家族酶，CYLD去泛素化酶，或OTUD3，或vOTU；

进一步优选地，所述USP家族酶包括USP1、USP2、USP4、USP5、USP6、USP7、USP8、USP9x、USP10、USP15、USP16、USP20、USP21、USP25、USP27x、USP28中的一种或多种；

S4、用含有可富集标签试剂标记泛素化修饰赖氨酸的ε氨基位点，得到S4样品；

S5、对S4样品进行蛋白水解酶进行酶切，得到S5样品；

S6、对应S4中可富集标签的方式，将S5样品中标记的泛素化修饰肽段进行富集。

2.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，所述USP家族酶与底物蛋白的质量比为：1：50-500，25℃-45℃条件下，酶切1-12h。

3.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，所述全蛋白质样品提取包括：利用7-9M尿素或3-5％脱氧胆酸钠或5-7M盐酸胍裂解液重悬待检测样品，再通过超声进一步裂解并释放细胞或组织中全蛋白，离心后取上清，即得。

4.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，S2步骤中：在全蛋白质样品中加入浓度为10-200mM的氨基活性试剂，加入浓度为5-100mM的氰基硼氢化钠，在16℃-80℃条件下，封闭0.25-12h，得到底物蛋白。

5.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，S4步骤中：在S3样品中加入浓度为5mM-50mM含有可富集标签的试剂，在16℃-80℃条件下，标记0.25-12h，利用超滤管或者分子排阻色谱对标记后样品中残留反应试剂进行去除，得到样品D。

6.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，S5步骤中：向S4样品中加入蛋白质水解酶，酶与蛋白质质量比为1：20-1：200，在16℃-45℃条件下，酶切2-24h，得到S5样品；所述蛋白质水解酶优选为胰蛋白酶trypsin、梭菌蛋白酶Arg-C、蛋白内切酶Glu-C、金属蛋白质内切酶Lys-N、胰凝乳蛋白酶chymotrypsin、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种或一种以上。

7.根据权利要求1所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，S6步骤中：向S5样品中加入10μL-100μL可对富集标签进行富集的试剂，孵育0.5-12h，得到结合修饰肽段的材料，利用洗脱液将富集的肽段从材料上洗脱下来，即得。

8.根据权利要求1-7任一项所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，

S2步骤中对自由氨基进行封闭的试剂为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、乙酸-N-琥珀酰亚胺、丙酸-N-琥珀酰亚胺、丁酸-N-琥珀酰亚胺、1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐中的一种及一种以上，优选为甲醛。

9.根据权利要求1-7任一项所述的蛋白质泛素化修饰富集方法，其特征在于，

S4步骤中所述氨基活性试剂为生物素标记试剂，S6步骤中的富集标记肽段的试剂为链霉素亲和素；和/或待检测生物样品为真菌、细胞、组织、血液及体液中的一种及一种以上。

10.一种蛋白质泛素化的检测方法，其特征在于，包括按照权利要求1-9所述方法得到富集后的泛素化修饰肽段，然后使用液相-质谱联用对富集的泛素化修饰肽段进行检测。