[发明专利]一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明属于引入外来遗传物质对细胞的修饰领域，具体涉及一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用。本发明的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，其保藏号为CGMCC No.45029，于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系具有以下特点：其一是筛选获得的细胞活力强，传代80代后仍能保持高的细胞活性及生物学特性，其二是由于采用非病毒转染思路，对细胞的影响较病毒转染更小，应用范围大，结果的评价性更加准确。

技术领域

本发明属于引入外来遗传物质对细胞的修饰领域，具体涉及一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

肠上皮细胞是研究上皮细胞生长和分化的重要模型。细胞体外模型可用于评估药物的通过或毒性、肠道致病菌菌株与肠上皮的相互作用，以及涉及消化道的其他生理或病理现象。体外肠屏障的毒理学研究主要基于原代或传代细胞、永生化肠上皮细胞、非肠源细胞系和共培养物的细胞培养。肠上皮细胞是排列在肠腔内的单层细胞，主要功能包括作为阻止外来有害物质如抗原、微生物及其毒素通过肠腔内的屏障；利用跨上皮细胞转运途径和细胞旁路转运途径，选择性通过来自食物中的营养素、电解质和水等物质穿过肠腔进入循环系统。

因牛、羊等大动物在体内研究中耗时费力等缺点，其肠上皮细胞的建立一直是研究的热点，国内外学者通过不同方法建立了稳定的牛、羊肠上皮细胞模型。但目前技术存在两个问题，首先，目前可以通过胶原酶消化法能够获得一定纯度的奶牛小肠上皮细胞，然而，这些细胞并没有被永生化，体外培养发现这些原代小肠上皮细胞只能仅仅传3-5代并伴随着大量的细胞衰老和凋亡，根本无法满足试验的需求。其次传代培养的肠上皮细胞纯度不够，在大多数物种情况下，从组织块中分离出小肠上皮细胞常常会有成纤维细胞的污染，这两种细胞夹杂生长。由于成纤维细胞增殖速度远远大于上皮细胞，当成纤维细胞增殖到一定程度会包围着小肠上皮细胞生长，最终抑制小肠上皮细胞的生长。

公告号为CN104928250B的中国发明专利公开了一种永生化奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法和应用，其微生物保藏编号为CGMCC NO.8707，其是以中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞作为宿主细胞，用携带有SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体感染宿主细胞，最终筛选获得稳定传代的永生化奶牛乳腺上皮细胞系。

肠上皮细胞在涉及消化道的生理或病理研究中具有重要作用。但肠上皮细胞的分离、纯化、培养非常耗时(可达一月至数月之久)，并且不容易分离获得活力很好的细胞，同时分离得到的肠上皮细胞在传至十几代之后即开始衰老并死亡，不能实现永生化。永生化的肠上皮细胞则可大大提高相关应用和研究的进度。通常情况下可使用活病毒载体或质粒转染诱导细胞永生化。使用SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体转染，虽然转染效率高，但由于是使用的活病毒，所以在未来的应用上受到限制。而采用质粒转染时，具有较好的应用前景，但较病毒转染获得永生化细胞的难度更大。

发明内容

本发明的目的是提供一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，传代近80代后仍能保持高的细胞活性及生物学特性，可大幅节省体外细胞模型的构建时间，并提高研究成果的准确性。

本发明的第二个目的是提供上述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系的构建方法。

本发明的第三个目的是提供上述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，其保藏号为CGMCC No.45029。

本发明的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。