[发明专利]烯还原酶突变体、工程菌及其制备(2R,5R)-二氢香芹酮的应用

权利要求书

1.一种烯还原酶突变体，其特征在于所述烯还原酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述烯还原酶突变体的编码基因。

3.一种含权利要求2所述编码基因的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述烯还原酶突变体在催化(5R)-香芹酮制备手性化合物(2R,5R)-二氢香芹酮中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含烯还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体超声破碎，取破碎混合液离心的上清液或上清液提取的纯酶为催化剂，以(5R)-香芹酮为底物，以NAD(P)+为辅因子，以醇脱氢酶或葡萄糖脱氢酶为辅酶，以异丙醇或葡萄糖为辅助底物，以pH 8.0-10.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-40℃，180-250rpm转速的摇床中反应完全后，反应液分离纯化，获得手性产物(2R,5R)-二氢香芹酮。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应体系中，催化剂用量以蛋白含量计为0.1-5mg/mL，所述底物加入终浓度2-20mM，所述NAD(P)⁺加入终浓度0.05-0.2mM，所述辅酶加入终浓度0.2-2U/mL，所述辅助底物加入终浓度为30-100mM。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应体系为：以所述上清液或纯酶为催化剂，以(5R)-香芹酮为底物，以NAD(P)⁺为辅因子，以葡萄糖脱氢酶为辅酶，以葡萄糖为辅助底物，以50mM、pH 8.0的PBS缓冲液构成。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述上清液按如下方法制备：(1)将含烯还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养16h；再将菌液以体积浓度1％的接种量接种至新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养至OD_600nm达到0.6-0.8；向培养液中加入终浓度0.2mM的IPTG，于25℃，180rpm振荡诱导培养12h，1,0000rpm离心10min，收集菌体后用PBS缓冲液悬浮菌体；(2)将步骤(1)的菌体悬浮液于4℃低温冰水浴下超声波破碎菌体，超声波破碎条件为：功率250W，3s开，4s关，温度为4℃，有效破碎时间为10min；超声波破碎混合液经15,000rpm离心25min后，吸取上清，获得含有目的烯还原酶突变体的粗酶液。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述纯酶采用Ni-NTA琼脂糖树脂纯化柱按如下方法制备：①平衡重力柱：用结合缓冲液冲洗柱子，洗脱2个柱体积；结合缓冲液：10mM咪唑，0.5mM NaCL，20mM NaH₂PO₄，pH 7.9～8.1；②样品液上柱：将收集的粗酶液按体积比1:1加入结合缓冲液混匀后，上样，上样量为4个柱体积，每次上样1个柱体积；③洗柱：用结合缓冲液洗脱至280nm处吸光度接近基线；④洗脱：用洗脱缓冲洗脱3次，每次洗脱1个柱体积，重力自然流出，分别收集每次的流出液，取第2次的流出液浓缩并用超滤管脱盐，获得所述的纯酶；所述洗脱缓冲液：250mM咪唑，0.5mM NaCL，20mM NaH₂PO₄，pH 7.9～8.1。