[发明专利]一种新型嗜热核酸内切酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了嗜热核酸酶Argonaute(PfAgo)蛋白的突变体及其制备方法和应用。本发明所述Ago突变体的酶催化活性较野生型显著提高，具有更好的高温热稳定性，并且突变体在靶标DNA底物选择性上对于野生和突变碱基具有更好的区分能力，这提高了其在核酸检测技术领域中的应用潜力，同时也为开发新的基因操作工具奠定了基础。

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域具体涉及激烈火球菌PfAgo的突变体，具体为，获得酶活性提高、热稳定性和底物特异性提高的突变体及其制备方法和应用。

背景技术

Argonaute(Ago)蛋白作为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的重要组成部分，对小分子RNA的剪切与招募发挥着非常关键的作用，是继RNA干扰(RNAi)发现之后颇受关注的一个蛋白家族。目前发现，Argonaute蛋白广泛存在于真核和原核生物中，并且在真核和原核生物中的功能各有不同，在真核生物中Ago蛋白主要参与RNAi过程，在形成RISC复合体中起到重要的作用；而在原核生物中，Ago蛋白主要起到宿主防御功能，参与细菌对外源基因入侵的防御机制以及参与宿主的复制及损伤修复。

TtAgo的体外切割实验证明了原核生物pAgos可利用ssDNA作为guide(向导链)去靶向切割target ssDNA或RNA(目标链)。Ago蛋白首先和guide-DNA结合形成二元复合物，其中Ago蛋白的MID结构域作为guide的5'端结合位点，PAZ结构域作为3'端结合位点，然后通过guide与target的碱基互补配对去靶向target DNA形成guide-Ago-target三元复合物，之后PIWI结构域在guide的第10和11位碱基之间进行切割，断裂target链，最后通过N结构域释放guide和被切断的target。PfAgo也是一种DNA引导的核酸内切酶，可以在超高温条件下定向剪切单链DNA靶标。

自从2016年韩春雨事件后，Ago蛋白的应用逐渐被众多生物学家一一挖掘出来。此后在2017-2021年间，陆续有多种Ago蛋白被表征出来，例如常温Ago蛋白中的CpAgo/IbAgo，在肠道微生物中提取出来的CbAgo/LrAgo。随着多种Ago蛋白被表征出来，一些应用也随之产生。2018至2019年冯雁教授团队(本课题组团队)利用PfAgo相继开发出了针对多重病原体核酸检测的RADAR(Renewed gDNA Assisted DNA cleavage with Argonaute)以及MULAN(MULtiplex Argonaute-based Nucleic acid detection)技术，以及针对肿瘤相关SNVs(Single nucleotide variants)富集检测的A-STAR(Ago-directed Specific Targetenrichment and detection)技术，2019年马立新团队开发出了PAND核酸检测技术。2020年Oost团队利用TtAgo发明了NAVIGATER核酸特异性富集技术，同年，本课题组发明了LAMP-RADAR病毒核酸检测技术以及一管式装置设计和反应管设计。2021年，Huimin Zhao等人，基于PfAgo开发出了快速、准确、便携式的检测COVID-19的SPOT(Scalable and PortableTesting)技术。

与现在常用的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a/13a酶类似，也有人建议将pAgos用作下一代基因组编辑工具。但是，由于其具有嗜热性(最佳活性温度≥65℃)和在20-37℃的相应温度下核酸内切酶活性水平较低，经过充分研究的TtAgo，PfAgo和MjAgo不太适合用于基因编辑。

目前相比于常温的NgAgo、CbAgo等，高温的TtAgo和PfAgo的应用前景反而更加广泛，因为Ago蛋白与CRISPR/Cas系统相比，最大的缺点就是不能打开DNA双链不具备解旋功能，这也是Ago蛋白为什么不能应用于基因编辑的最重要的一个原因。但是，在高温条件下DNA可自行打开双链，这就可以让Ago蛋白起到核酸酶的剪切作用了，因此才有了核酸检测技术。