[发明专利]一种胚胎干细胞无血清保存液及其制备方法和应用

说明书

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种胚胎干细胞无血清保存液及其制备方法和应用。所述保存液包括以下体积百分比的组分：血小板裂解物10～30％、低分子量γ‑聚谷氨酸1～5％及基础培养基余量。本发明提供的冷冻保存液不含血清和DMSO，其特别适用于冻存胚胎干细胞，特别是人胚胎干细胞，经多批次试验表明，采用本发明冷冻保存液结合玻璃化冷冻法保存胚胎干细胞，冻存效果与经典血清+DMSO组合相当，但是毒性更低，与现有技术相比取得了显著的进步。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种胚胎干细胞无血清保存液及其制备方法和应用。

背景技术

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hES细胞)是从早期的胚胎内细胞团(inner cell mass，ICM)分离培养成的多能干细胞，其在体外培养过程中可以维持干细胞的未分化状态，正常的二倍体核型及无线的增殖能力，具有内分化能力和种系的嵌合能力，并可在体外进行各种基因操作，因此，hES细胞具有广阔的临床应用前景。

目前，hES细胞常用的冷冻保存方法包括慢速冷冻法和玻璃化冷冻法，两种方法在冷冻过程中需要结合冷冻保护剂使用。其中，慢速冻存法的复苏率约为16％，并且复苏后大量细胞会分化；国际上报导的玻璃化冻存法冻存hES细胞的存活率在75％左右。

现有的冷冻保护剂主要分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，其中，渗透性冷冻保护剂多为小分子中性物质，其能够弱化水结晶过程以及减少对细胞结构和功能的破坏，常用的有甘油、DMSO、丙二醇、乙二醇、乙酰胺、甲醇等。其中，DMSO是临床常用的冷冻保护剂，常以10％DMSO配合90％FBS来冷冻保存干细胞，但是一系列的研究表明，DMSO可能会改变染色体的稳定性，并导致细胞端粒长度的变化，从而导致肿瘤的形成，并且DMSO本身也具有一定的毒性，DMSO对组织和细胞的毒性取决于暴露时间、温度和浓度；另外，FBS作为异源动物成分，存在引入病毒的风险，同时受血清生产批次、来源及组分的影响，对冷冻保存的干细胞可能存在不良的影响。因此，尤其需要低毒性，无血清的冷冻保存液。

人血小板裂解物来源于人类血小板，不容易引起异种蛋白的免疫，且包含种细胞生长因子，在中国专利申请CN108617638A中，发明人提出了一种细胞冻存保护液，其包括血小板裂解物、渗透性保护剂、非渗透性保护剂和血清，发明人证实了，该保存液相比不含血小板裂解物的冻存保护液能够更好的保护冻存的细胞，冻存的细胞活力和活率明显提高，且对原代培养后的细胞活率无影响。但是该保存液仍然需要加入4～70％体积分数的血清。Wang等通过使用97％人类血小板裂解物+3％DMSO来冻存hADSC，复苏后发现细胞的存活率高于80％，与95％FBS+5％DMSO冻存存活率无明显差异，且可以减少DMSO的浓度，同时可释放多种生长因子促进hADSC体外增殖，对于血小板裂解物促进细胞的生长基质及其在其他干细胞中的冻存效果还需进一步了解^[1]。但是该冻存液中仍然需要添加3％的DMSO。

目前未见采用人血小板裂解物来培养hESCs的例子。

[1]Wang C，Xiao R，Cao YL，etal.Evaluation of human plateletlysate an ddimethyl sulfoxide as cryoprotectants for the cryopreservation of human adipose-derived stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,491(1):198-203.

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有冻存液的缺陷和不足，提供一种胚胎干细胞无血清保存液，其特点在于不含有血清和DMSO。该冻存液可以提高细胞的冷冻存活率，与玻璃化冷冻结合冷冻保存胚胎干细胞复苏率可以达到95％以上，且细胞复苏后维持不分化的状态。

本发明的目的是提供一种胚胎干细胞无血清保存液，包括以下体积百分比的组分：