[发明专利]免疫mRNA及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了免疫mRNA及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。所述免疫mRNA的制备方法，具体是在采用体外转录合成mRNA，其特征是，在体外转录合成mRNA时，掺入5～15mol％的5‑甲基胞苷和5～15mol％的2‑硫尿苷用于化学修饰体外转录合成。采用本发明所述方法制得的免疫mRNA递送后的稳定性及蛋白合成效率得到显著上升，可提高其在递送后抗口腔上皮细胞侵染的能力，且在递送口腔上皮细胞后能减弱与模式识别受体(TLR3、TLR7、TLR8及RIG‑I)的结合，降低mRNA递送的免疫反应。

技术领域

本发明涉及免疫mRNA及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

mRNA是以DNA的一条链作为模板转录而来、携带有遗传信息、可以指导蛋白质合成的单链核糖核酸，从1961年发现mRNA至2019年，市面上尚无mRNA药物获批应用于临床。然而，近十年来，mRNA递送系统和核酸化学的不断发展推进了mRNA疗法的临床前开发，加速了mRNA发展成为一种新型核酸药物的进程。2021年获紧急授权使用的两款mRNA疫苗在新冠疫情爆发后短短一年时间左右便推向临床，且保护效力超过90％，体现了mRNA疫苗的优越性。

牙周炎与心血管疾病、糖尿病、妊娠不良、风湿性疾病、心理疾病等全身性疾病密切相关。2018年第四次“全国口腔健康流行病学调查报告”数据显示，我国80～97％的成年人存在不同程度的牙周问题。迄今，牙周炎已被认为是仅次于肿瘤和心血管疾病，危害人类健康的第三大疾病。牙周炎的抗生素治疗会带来病原菌抗性患者过敏及非特异性作用等问题，因此发展抗生素治疗的替代方法是亟待解决的问题。自2020年初新型冠状病毒肺炎疫情爆发以来，mRNA疫苗的应用使mRNA递送成为研究的热点。在应用过程中，mRNA递送的不稳定及诱发的免疫反应等问题一直是该领域研究的热点。

现有技术中体外转录合成天然免疫蛋白mRNA(如S100A8/A9、抗菌肽CAMP)递送口腔上皮细胞，能够表达出相应的蛋白，提高其抗李斯特菌或沙门氏菌侵染的能力，但存在以下不足：(1)mRNA递送的效率低；(2)递送后与细胞病原模式识别受体结合，诱发较强的免疫反应。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供递送效率高，且可降递送的免疫反应的免疫mRNA及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

化学修饰合成免疫mRNA的方法，采用体外转录合成mRNA，具体是在体外转录合成mRNA时，掺入5～15mol％的5-甲基胞苷和5～15mol％的2-硫尿苷用于化学修饰体外转录合成。

本领域公知，在体外转录合成mRNA时需以核苷三磷酸混合物NTPs(包括腺苷三磷酸ATP，尿苷三磷酸UTPutp，胞苷三磷酸CTPctp和鸟苷三磷酸GTP)为原料，本发明所述方法中，所述的掺入5～15mol％的5-甲基胞苷和5～15mol％的2-硫尿苷是指，核苷三磷酸混合物中使用的尿苷由5～15mol％的2-硫尿苷和95～85mol％的尿苷三磷酸组成，使用的胞苷则是由5～15mol％的5-甲基胞苷和95～85mol％的胞苷三磷酸组成。申请人通过试验发现，通过掺入5～15mol％的5-甲基胞苷和5～15mol％的2-硫尿苷用于化学修饰体外转录合成能够显著提高免疫mRNA的稳定性及蛋白合成效率，并显著增强口腔上皮细胞抗牙龈卟啉单胞菌(ATCC 33277)侵染的能力；而且该化学修饰免疫mRNA递送口腔上皮细胞后也能显著减弱与模式识别受体(TLR3、TLR7、TLR8及RIG-I)的结合，降低mRNA递送的免疫反应。