[发明专利]增强红色糖多孢菌的红霉素生产能力的方法及其获得的菌株

说明书

本发明涉及红色糖多孢菌中SACE_3478基因扰动对于提升红霉素产量的应用，具体公开一种增强红色糖多孢菌的红霉素生产能力的方法，其通过基因工程手段将出发菌株红色糖多孢菌中SACE_3478基因进行敲除、失活、表达降低、或编码的蛋白活性降低或丧失，以显著提高红霉素的产量的应用。

技术领域

本发明属于微生物和生物技术领域。更具体的说，本发明涉及红色糖多孢菌中SACE_3478基因扰动对于提升红霉素产量的应用，更具体涉及将红色糖多孢菌中编码长链脂肪酸辅酶A连接酶的SACE_3478基因利用基因工程手段进行敲减，可显著提高红霉素的产量的应用。

背景技术

红霉素是由红色糖多胞菌（Saccharopolyspora erythraea）产生的大环内酯类抗生素，其抗菌谱广，对于葡萄球菌、肺炎链球菌等革兰氏阳性菌，以及流感嗜血杆菌、痢疾杆菌等革兰氏阴性菌等均有较强的抑制作用，因此具有重要的应用价值。红霉素是我国需求最大的抗生素之一，但生产能力仍显不足，对于红霉素产量提升的工作也一直在进行中。目前，针对红霉素效价提升的工作主要集中在随机诱变获得高产突变株，以及培养基成分改进，发酵过程优化等方面，缺乏基因组水平上的理性设计和基因改造，这一现状极大的制约了红霉素生产菌株的改造和在工业上的应用。

红霉素是红色糖多孢菌的次级代谢产物，其生物合成基因簇ery中缺乏途径特异性转录调控因子，这使得无法通过常规的调控因子工程来理性提高红霉素产量。但除了转录调控外，前体供应、副产物竞争、生物合成基因的适配表达等因素也会极大的影响次级代谢产物的产量，因此相关基因和途径也可能成为理性改造菌株的靶点。1分子红霉素的生物合成需要使用初级代谢过程产生的1分子丙酰辅酶A和6分子甲基丙二酰辅酶A小分子前体，前体的供应直接影响了次级代谢产物的产量。通过选择调控细胞内代谢流向不同途径的流动，可以作为理性设计改造菌株提升红霉素产量的重要途径。

反义RNA抑制策略是近年来常用的下调基因表达水平的方法之一，其原理是通过设计表达一段与靶标基因反向互补的小RNA（sRNA）序列，使其与靶基因的mRNA结合，从而使mRNA无法与核糖体结合而启动翻译过程，诱导mRNA自发降解，以达到敲减靶标基因表达水平的目的。此方法的优点是无需基因敲除就可以对靶标基因的功能进行研究，构建周期更短，对于研究基因敲除导致细胞死亡的必需基因尤其适合，并且基因下调的强度可以通过调整质粒拷贝数和sRNA前启动子的强度来调节。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一个理性改造红霉素生产菌提升产量的目标改造位点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

步骤一、通过对于红霉素生产的原始菌株和多个高产突变菌株的发酵和基因组序列比对，找到高产菌株共有的突变位点；

步骤二、通过反义RNA抑制策略构建目标基因敲减菌株以及含有空质粒的对照菌株；

步骤三、对原始菌株、对照菌株、敲减菌株进行24孔板发酵；

步骤四、用化学显色法测定各菌株的红霉素效价，并总结目标基因对于红霉素生物合成的影响。

优选的是，所述的红色糖多孢菌中SACE_3478基因敲减对于提升红霉素产量的应用中，所述步骤一、二、三、四中，红霉素生产的原始菌株及各个突变及改造株的出发菌株均为Saccharopolyspora erythraea NRRL23338或者它的突变株。