[发明专利]新型冠状病毒特异性单克隆抗体的制备及其应用

说明书

本发明针对新型冠将病毒S蛋白设计多肽，先与血蓝蛋白KLH融合作为抗原，免疫小鼠后取小鼠脾脏细胞和SP20融合，经过筛选培养基的筛选以及扩大培养，ELISA法检测，获得3株特异性识别新型冠状病毒S蛋白484赖氨酸的小鼠单克隆抗体。该单抗除了可以应用于SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白第484位点是否存在从酪氨酸到赖氨酸的突变(例如新型冠病毒南非突变株)的检测试剂盒，还可以应用于相关疫苗研发过程中的鉴别实验等。

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及新型冠状病毒特异性单克隆抗体的制备及其应用，更具体涉及新型冠状病毒S蛋白的特异性单克隆抗体及制备方法和用途。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由一种新的β冠状病毒-新型冠状病毒(SARS-CoV-2病毒)引起新型冠状病毒肺炎简称“新冠肺炎”，是指2019新型冠状病毒（COVID-19，SARS-CoV-2）感染导致的肺炎。新型冠状病毒属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140 nm。新冠病毒(SARS-CoV-2)有四种主要的结构蛋白：刺突蛋白（Spike protein，S蛋白），核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N蛋白），膜蛋白（Membrane protein，M蛋白），包膜蛋白（Envelope protein，E蛋白）。

目前，已经成功上市的新冠疫苗，除了全病毒的灭活疫苗，都集中于S蛋白有关的亚单位疫苗的开发。新型冠状病毒容易突变，目前流行的突变株501Y.V2(南非突变株，B.1.351)和501Y.V3(巴西突变株，P.1)，其中一个重要突变就是S蛋白的484位氨基酸的突变，从原型株的谷氨酸（484E）突变成了赖氨酸（484K）。

因此，研发特异性识别该赖氨酸突变的小鼠单克隆抗体，不仅可以用于特异的检测484K突变的新型冠状病毒，还可以用于484K突变的新型冠状病毒疫苗研发过程中的鉴别，检测等。目前所有的研究者都是基于蛋白免疫原获得型特异抗体，但是获得率极低，获得的抗体交叉性强，不能有效识别特定的型别。本发明为了解决现有技术的这一个缺陷，设计了特定的免疫原，获得了三株型特异性抗体。

发明内容

本发明的目的是研制特异性识别该位点赖氨酸的单克隆抗体，首先设计该位点为赖氨酸的多肽作为免疫多肽，同时，再设计该位点为谷氨酸的多肽作为检测多肽；多肽免疫小鼠后，除了选择血清滴度高的小鼠，优选选择识别免疫多肽和南非突变株RBD蛋白信号比对应的检测多肽和WT RBD蛋白信号值高的小鼠进行融合；在后续的克隆筛选中，也是优选选择识别免疫多肽和南非突变株蛋白信号强的克隆，最终筛选出10株阳性克隆。进一步研究发现，其中CoV 77D5、CoV 79G10、CoV 79A5这3株克隆识别免疫多肽比检测多肽信号明显强，由于免疫多肽和检测多肽的唯一差别就是赖氨酸和谷氨酸，可以确认该三株小鼠单克隆抗体为特异性识别新型冠状病毒S蛋白484赖氨酸的抗体。

本发明提供一种新型冠状病毒多肽抗原，其特征在于，其是有新型冠状病毒S蛋白中以CNGVKGFN为核心序列的随机长8-25个氨基酸的多肽。其中最大范围是：RDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQS，最小范围是：CNGVKGFN。在这个范围的大小是随机选择的，多肽一般选择15-20个附近数量的氨基酸。

优选地，进一步与血蓝蛋白KLH偶联作为抗原多肽，更优选采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯作为耦联剂。

在一个具体实施方式中，其氨基酸序列为RDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQS；或者为CNGVKGFN。

本发明由此提供所述的新型冠状病毒多肽抗原在制备新型冠状病毒抗体中的应用。