[发明专利]阴离子调控的功能化介孔聚离子固定化脂肪酶催化剂的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种阴离子调控功能化聚离子液体固定化脂肪酶在高效生产生物柴油中的应用，通过调节聚离子液体的阴离子（Br^‑、SO₄^2‑、OH^‑）和官能团（羧基、羟基、环氧基），为脂肪酶的固定化提供了一种绿色策略，并显示出促进生物柴油生产的协同效应；制备的带有羧基和SO₄^2‑的固定化酶催化剂PPL_0.2@PIL‑COOH‑S具有稳定高效的催化活性，其在24小时内通过转化大豆油获得了96.6%的最高生物柴油产量，超过了游离PPL（66.3%）和商业Novozym 435（68.5%）；PPL_0.2@PIL‑COOH‑S催化剂的合成步骤简单，耗时短，易于从反应体系中分离，可循环利用，猪胰脂肪酶本身价格也较其他脂肪酶低，在工业应用中有着良好的前景。

技术领域

本发明涉及一种阴离子调控的功能化介孔聚离子固定化脂肪酶催化剂的制 备方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

由于化石能源的迅速枯竭，可再生资源作为替代品具有广泛的吸引力。生物 柴油被定义为来自天然可再生材料的长链脂肪酸的单烷基酯，如葵花籽油、棕榈 油、鱼油、大豆油和废食用油，它们可以通过酸、碱和酶的催化作用与醇类转化。 由于脂肪酶对油品质量的变化有较好的耐受性，而且它们可以以高选择性催化酯 化和酯化反应，因此脂肪酶催化剂成为生物柴油生产中绿色溶剂和温和条件的良 好选择。

脂肪酶是一种广泛用于食品和医药行业的酶，可以催化三酰甘油的水解、酯 化、转酯化。其中，猪胰腺脂肪酶(PPL)(三酰甘油水解酶；EC 3.1.1.3)是由 449个氨基酸组成的单链，由于其与其他脂肪酶相比价格低廉，活性较好，是使 用最广泛的脂肪酶之一。尽管如此，游离形式的脂肪酶从来不是最好的选择，因 为其操作稳定性低，回收困难，而且游离脂肪酶对外部环境，如高温和强酸、强 碱很敏感，因此实际应用受到严重阻碍。固定化是一种常用的策略，通过调控酶 和载体材料之间复杂的相互作用，如物理吸附、封装、共价结合和交联等四种典 型方法来调节酶的活性、稳定性、选择性、特异性和纯度。一般来说，物理吸附 的相互作用力最弱，对PPL的初始结构影响最小，表明反应过程中存在浸出的 风险。但静电吸附和非共价键(氢键)与传统的物理吸附的结合可以帮助切断浸 出效应。固定化的生物杂化材料可以将酶的精细特异性和效率与材料的坚固特性 相结合，有助于实现酶在许多领域的广泛应用。

许多经过表面修饰的载体材料，如金属有机框架(MOFs)，功能性聚合物。 磁性纳米粒子，碳纳米管和纳米纤维被用于提高脂肪酶的活性和稳定性。而载体 材料的疏水性、氢键、功能团、中孔、自由阴离子都是提高固定化酶活性的有利 因素，尤其是自由阴离子，在已经被证明的Hofmeister序列中，阴离子使蛋白质 变性的能力从左到右逐渐增加，然而事实上，左边的硫酸盐基团稳定了蛋白质的 天然结构。具有可调整的高离子位点密度、阴离子种类、各种官能团和可调整的 孔隙结构的聚(离子液体)被认为是有前途的酶固定化载体，因为它具有减少传质 限制、在反应溶液中的高分散性、反应后容易恢复原有尺寸和机械特性等优点聚 离子液体中的阴离子可以通过离子交换过程改变其理化性质(密度、粘度、融合 点、极性等)，从而对酶的稳定性、恢复性和活性产生积极的影响。此外，聚(离 子液体)的亲疏水特性很容易调整，并对脂肪酶起到积极作用。因此，开发用于 酶固定化的聚离子液体载体是一个重要的课题，因为它们具有独特的尺寸和机械 特性，为酶固定化的优良载体提供了许多有希望的特性。

到目前为止，许多研究都集中在通过改变脂肪酶的结构，使其成为具有完全 暴露的活性中心的开放形式来提高其活性。而对于载体材料的离子位点、官能团、 氢键对脂肪酶固定化以及酶的性能的协同作用却很少被研究。在这项工作中，介 孔聚(离子液体)功能技术的优势被应用于设计一种高效、稳定的生物柴油生产酶 催化剂。以PPL为催化中心，成功构建了各种具有可调控阴离子和定制表面官 能团的功能性介孔聚离子液体，进一步优化了生物催化剂的活性和稳定性，以便 在不同的反应条件下以大豆油生产生物柴油。