[发明专利]一种葡糖基转移酶突变体及其应用

说明书

本发明公开一种葡糖基转移酶突变体及其应用，属于蛋白质工程技术领域。本发明使用生物信息学手段，通过蛋白建模、结构分析等方法确定若干个位于非保守区域的蛋白表面氨基酸，并进行单个或组合突变，得到的突变体在SEQID NO.1所示氨基酸序列的野生型UDP‑葡糖基转移酶中突变A11L、F39Y、S58G、S55P、N109K、A250E、I279L、V304L和T329I中的至少一个位点。得到的突变体较野生型UDP‑葡糖基转移酶热稳定性和酶活均显著提高，在甜味剂甜菊糖苷(莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷E)的工业化生产中应用，可提高生产效率，降低生产成本，市场前景广阔。

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，公开了一种活性及热稳定性提高的UDP-葡糖基转移酶突变体及其应用。

背景技术

近年来，基于不断扩大的精细化合物市场以及用绿色生物法取代化学法的需求。一些难以从天然植物中提取的物质，传统提取工艺中通常会面临着产量低，能耗大等问题，而化学合成方法可能也无法合成一些天然大分子化合物。随着合成生物学、代谢工程等生物学领域的不断进步，生物酶法实现天然高价值化合物的可持续生产合成已成为行业趋势。

糖基转移酶(EC2.4.1.x)是一种普遍存在与生物体中的转移酶，在植物和微生物的次生代谢物合成中有重要的作用，催化糖基供体向受体分子进行糖基的转移。UDP-葡糖基转移酶以UDP-glucose为糖基供体，在黄酮类、生物碱类、萜类和低聚糖类化合物的生物生产中被广泛研究。葡糖基转移酶具有高度的区域选择性及立体选择性，并且其底物混杂性也使其拥有合成多种物质的能力。

甜叶菊叶片中提取的甜菊糖苷，作为一种甜度约为蔗糖200倍的天然代糖，其热量接近零，稳定性高，有望成为日常饮食中的甜味剂替代品。甜菊糖苷由于其分子结构中的甜菊醇，具有一定的后苦味，但其支链上葡糖基数量及结合位点均会影响其甜度及风味。目前市面上的甜菊糖产品主要成分为甜菊苷及莱鲍迪苷A，莱鲍迪苷D作为甜度及风味更优的甜菊糖苷成分，由于其在天然甜叶菊提取物中含量极少，不易提取，不利于其大规模生产应用。在天然合成途径中，葡糖基转移酶以UDP-glucose及莱鲍迪苷A(Reb A)为底物，可以合成莱鲍迪苷D(Reb D)。

在实际应用中，酶的性质(如稳定性及酶活)影响工业生产的成本，不利于其推广及应用。因此对酶稳定性及催化活力的改造，是生物催化合成生产领域研究的重点。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种UDP-葡糖基转移酶突变体。该突变体其耐热性及酶活显著提高，有利于其在甜菊糖合成领域的广泛应用。

本发明的另一目的在于提供上述葡糖基转移酶突变体的应用。

本发明利用RoseTTAFold2进行AI建模，基于该模型对人参来源的UDP-葡糖基转移酶进行定点突变，并基于该结果进行组合突变。提供了一种热稳定性及酶活更优的，可应用于莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷E合成的UDP-葡糖基转移酶突变体，具有重要的产业化价值和意义。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明首要目的提供一种UDP-葡糖基转移酶突变体，所述的突变体在SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的野生型UDP-葡糖基转移酶中突变至少一个氨基酸位点，包括：A11L、F39Y、S58G、S55P、N109K、A250E、I279L、V304L、T329I中的一个或几个组合。

在本发明的一些实施方案中，所述突变为A11L、或F39Y、或S58G、或S55P、或N109K、或A250E、或I279L、或V304L、或T329I。