[发明专利]一种猪瘟E2蛋白基因、猪伪狂犬病毒gD蛋白基因及其应用

说明书

本发明涉及猪瘟E2蛋白基因、猪伪狂犬病毒gD蛋白基因及其应用。本发明将截去跨膜疏水区的猪瘟E2蛋白、伪狂犬gD蛋白基因重组构建至pCHO1.0质粒，并将重组后质粒通过脂质体转染，双加压筛选的方式成功构建了稳定表达猪瘟E2蛋白、及伪狂犬gD蛋白的CHO工程细胞系。该方法所构建的CHO工程细胞系表达的猪瘟E2蛋白、伪狂犬gD蛋白免疫原性好，表达产量高，免疫后便于临床血清与诊断及猪场猪瘟、伪狂犬病原的净化，可一针两防。具有较高的经济效益和市场前景。

技术领域

本发明属于基因重组疫苗技术领域，具体涉及猪瘟E2蛋白基因、猪伪狂犬病毒gD蛋白基因及其应用。

背景技术

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病，其主要特征是急性型以败血性变化为主，实质器官出血、坏死和梗死,慢性型则呈纤维素性坏死性肠炎变化。猪瘟是危害养猪业的主要传染病之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。在《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020)》中，猪瘟也被列为优先防控的重大动物疫病之一。CSFV基因组长约12.3kb,仅含有一个大的开放性阅读框(ORF)，翻译成一种多聚蛋白，通过加工为1个结构蛋白和3个囊膜糖蛋白，即Ems(E0)、E1和E2，其中E2蛋白具有很好的免疫原性，能诱导机体产生高水平的病毒中和抗体,CSFV表面的单抗决定簇主要分布在E2蛋白上。

我国于1954年成功研制猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)推广至今，我国的猪瘟疫情得到了有效控制，但未根除。目前被广泛应用的CSFV疫苗株有中国的C株、日本的GPE株、法国的Thiverval株等，其中中国的C株是国际上公认的安全有效的疫苗株，该毒株免疫原性好、免疫谱广、安全性高、遗传性稳定。2008年，中国兽药监测所等单位利用猪瘟兔化弱毒疫苗接种传代细胞，成功研制出的新一代的猪瘟弱毒活疫苗，获农业部批准生产。猪瘟免疫防控的疫苗仍以猪瘟兔化弱毒细胞苗、传代细胞苗、脾淋苗为主。但经典C株不能区分野毒株感染，免疫效果易受母源抗体的干扰，给猪瘟疫病的防治及净化带来了很大的困难。亚单位疫苗目前国内普及使用较少。获得文号厂家目前只有一家。

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的多种动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。目前，伪狂犬病在世界范围内广泛流行，其中猪最易感，发病也最严重，是病毒的长期储存者和排毒者，且具有高致死率。疫苗接种是预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病主要的措施之一。国内外已研制出猪伪狂犬病的灭活疫苗、弱毒疫苗、基因缺失弱毒疫苗已经相对成熟弱毒活疫苗是将分离到的野毒株经非猪源细胞反复传到，或适应鸡胚、或加入致突变剂在高于一般的培养温度下，在细胞上反复传代而获得的疫苗，如匈牙利的Bartha株、罗马尼亚的Bucharest株、BUK株、TK200株等。我国广泛使用的PR弱毒冻干疫苗(Bartha-K61)是gI/gE双击因缺失弱毒疫苗，由于该基因缺失而进一步阻断弱毒疫苗返毒的可能性。但弱毒活疫苗与E2联合使用时存在抗原相容性问题，且仍然存在不能区分野毒株感染，免疫效果易受母源抗体的干扰的问题。

为有效预防猪瘟和猪伪狂犬病这2种疾病，同时区分野毒株感染，国内外有许多相关亚单位疫苗的研究，但全部为单苗，关于CSFV和PRV二联亚单位疫苗未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组载体，它是包含权利要求1所述基因片段的质粒；所述质粒为pCHO1.0质粒。

本发明还提供了一种重组细胞，它是包括前述重组载体的大肠杆菌、酵母、昆虫、植物或者哺乳动物细胞中的任一种，优选哺乳动物细胞。

进一步地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞；所述CHO细胞包括CHO-K1、CHO-S、CHO-DXB11、CHO-DG44、CHOZN GS、CHOK1SV GS-KO，优选CHO-S。