[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，选择G2型PEDV毒株作为研究对象；

步骤2，分析G2型PEDV毒株的基因组序列特征，找出G2型PEDV毒株S基因编码氨基酸序列中特有的氨基酸突变区域；

步骤3，利用基因的克隆和载体构建技术，将PEDV感染性克隆受体结合域(ReceptorBinding Domain，RBD)替换成AscI酶切位点；

步骤4，使用人工细菌染色体技术(BAC)，获取pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)质；

步骤5，将提取得到质粒pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)用AscI酶切线性化；

步骤6，线性化产物使用乙醇沉淀回收，回收产物与RBD突变体连接得到RBD突变质粒pBAC-PEDV(mut)，完成猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建。

2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，将猪流行性腹泻G2株在Vero-CCL81细胞上传至P3代。

3.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，将感染有G2型PEDV毒株的仔猪的空肠肠道组织样品剪碎后匀浆，3000r/min离心5分钟，取上清用0.22μm的滤器过滤除菌，接种生长良好的T-25单层Vero细胞，孵育1h后，弃去病毒液，用PBS清洗三次细胞后，加入10μg/ml胰酶的MEM培养基，置于37℃、含5％CO2的恒温培养箱中培养7日，观察是否出现细胞病变，如此盲传至细胞出现病变，收集培养物，冻融三次并命名，置-80℃以下超低温冰箱中保存。

4.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤3中，利用反向遗传技术，实现了对PEDV的感染性克隆。

5.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤3中，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将原始pBAC-PEDV质粒的RBD替换成一个AscI酶切位。

6.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤3中，将RBD上游GG与下游CC之间的序列替换成CGCG形成一个AscI酶切位点，替换后的序列如下：GCTTTTGACCTTGACGATGGCGCGCCAAGTATACTATCTATGGCT。

7.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤4中，以pTargetF质粒为模板，用AscI-N20-F/AscI-N20-R引物进行PCR扩增sgRNA，以pBAC-PEDV质粒为模板，分别用AscI-updonor-F/AscI-updonor-R和AscI-downdonor-F/AscI-downdonor-R引物扩增上游供体和下游供体，得到一个新的质粒pBAC-PEDV(ΔRBD::AscI)。

8.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，所述步骤6中，将连接产物转化TG1，涂布于LB+壮观霉素平板，37℃培养过夜，再通过感受态制备和质粒电转化操作。

9.根据权利要求8所述的一种猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，从上述培养过作的平板上挑取大小中等形态正常的大肠杆菌单克隆至LB+Spe液体培养基，37℃220r/min培养，等菌液培养至肉眼可见混浊时用AscI-N20-F/AscI-downdonor-R引物进行菌液PCR验证。

10.一种采用权利要求1～9任意之一所述的构建方法制备得到的猪流行性腹泻病毒感染性克隆。