[发明专利]斑马鱼排卵障碍模型的构建方法、检测方法及应用

权利要求书

1.用于斑马鱼cyp21a2基因敲除的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的DNA序列为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。

2.一种CRISPR/Cas9组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的sgRNA或编码权利要求1所述sgRNA的DNA，以及Cas9蛋白。

3.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的CRISPR/Cas9组合物在制备斑马鱼排卵障碍模型的应用；优选地，所述应用为在构建斑马鱼高雄激素和高促黄体激素不孕模型中的应用。

4.一种cyp21a2基因功能缺失的斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)将权利要求1所述的sgRNA和Cas9蛋白共同导入斑马鱼受精卵中；

(b)培养获得稳定遗传的cyp21a2基因功能缺失的斑马鱼突变体。

5.根据权利要求4所述的制备方法获得的斑马鱼基因突变体，其特征在于，斑马鱼cyp21a2基因第二外显子上46bp片段被敲除，被敲除的序列如SEQ ID No.5所示。

6.一种斑马鱼排卵障碍模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(A)设计并合成用于靶向斑马鱼cyp21a2基因第二外显子的sgRNA；所述sgRNA的DNA序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

(B)将有活性的sgRNA和Cas9蛋白的组合物经显微注射入斑马鱼受精卵中；

(C)培育显微注射后的受精卵，获得F0代斑马鱼，将阳性斑马鱼与野生型杂交，得到F1代杂合子，自交，得到F2代纯合突变体，即得斑马鱼排卵障碍模型。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述方法还包括将得到的F2代纯合突变体培养至成鱼，选出雌鱼，检测激素水平，获得斑马鱼高雄激素和高促黄体生激素不孕模型。

8.根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA和Cas9蛋白的组合物中，sgRNA的终浓度为80-150ng/μL；Cas9蛋白终浓度为200-300ng/μL；优选地，每个受精卵注射所述组合物的体积为0.8-1.2nL。

9.用于检测权利要求6-8任一项所述的构建方法得到的斑马鱼模型的引物序列，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

10.权利要求6-8任一项所述构建方法得到的斑马鱼模型在排卵障碍相关的疾病的药物研究或药物筛选中的应用。