[发明专利]一种一体化手持型数字核酸检测仪及核酸检测方法

说明书

本发明公开了一种一体化手持型数字核酸检测仪及核酸检测方法。该核酸检测仪包括集成为一体的芯片加样封装系统、热循环系统和检测分析系统；芯片加样封装系统包括微孔型dPCR芯片以及对微孔型dPCR芯片进行封装的封装盖片；热循环系统用于对微孔型dPCR芯片进行热循环；检测分析系统用于拍摄热循环结束后的微孔型dPCR芯片的荧光图像，并对荧光图像进行处理和分析。通过将芯片加样封装系统、热循环系统和检测分析系统三个部分小型化后集成为一台仪器，简化仪器结构降低仪器成本；并提出了一种基于PDMS和Parylene C多层结构的微孔型dPCR芯片柔性封装工艺，解决了微孔性数字PCR芯片由于矿物油液封引起的样品蒸发和交叉污染的问题。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种一体化手持型数字核酸检测仪及核酸检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)可以在体外对核酸进行特异性扩增，是核酸检测的金标准。对于双链核酸即脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)，PCR过程主要包括两个部分：热启动和热循环。热启动是在高温下(约95℃)激活预混液中聚合酶的活性；热循环是促使DNA在聚合酶的作用下进行复制。一个热循环通常包括三个生物学过程：高温变性、低温退火和中温延伸。在变性(约95℃)过程中，双链DNA内部链与链之间的氢键被破坏，一条DNA双链被分解为两条单链DNA。然后在退火(约55℃)过程中，PCR预混液中的引物与单链DNA上的靶基因片段结合。在延伸(约72℃)过程中，在聚合酶的作用下将剩余的单链DNA序列合成双链DNA。理想情况下，在每个热循环结束后，DNA的拷贝数将会加倍。

为了量化PCR产物，实时荧光定量PCR技术在PCR预混液中加入荧光染料，利用其与DNA结合产生荧光的工作原理，对PCR过程进行实时观测和定量分析，以此实现对目标基因(靶基因)的检测，目前实时荧光定量PCR技术已经成为PCR检测领域的主流方法。

为了实现对痕量靶基因的定量检测，在传统PCR的技术上发展出了数字PCR技术(dPCR,digital PCR)。是将含有荧光染料的PCR预混液平均分配到成千上万个反应腔中，也就是将预混液中的所有靶基因随机分配到这些反应腔中，有的腔室内没有靶基因，有的腔室内含有至少一个靶基因。然后对这些反应腔进行热循环处理，让分配在这些反应腔内部的PCR预混液同时进行聚合酶链式反应。在反应结束后，含有靶基因的反应腔与没有靶基因的反应腔之间的荧光强度会有明显的区别。dPCR技术所需的样品分割方法是基于微流控技术完成的。根据预混液的加样方式，主要分为液滴式dPCR(droplet-based dPCR，ddPCR)和芯片式dPCR(chip-based dPCR，cdPCR)。ddPCR技术，利用微液滴发生器，将PCR预混液均匀地分割并包裹在油滴内，形成油包水液滴的虚拟反应腔。cdPCR技术，通过在硅/聚合物基底上利用微纳米加工技术，形成微流控通道和微反应腔，然后样品通过芯片流路或者直接移液的方法加载到芯片上，通过微加热器对微反应腔进行热循环处理，利用图像处理算法对各个反应腔的荧光强度进行提取与分析

微孔型数字PCR芯片主要是通过半导体加工技术和软光刻技术在基底材料硅或者聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)上制备出大量独立的微孔，作为PCR反应腔。通过对微孔阵列芯片表面的化学处理，让PCR预混液均匀地分布在各微反应腔内部，然后在芯片表面覆盖硅油，防止反应腔室间样品的交叉污染和温度变化过程中溶液的蒸发，最后对整个芯片进行封装。将封装好的芯片放入热循环系统中进行PCR过程。循环结束后，对产生荧光的微反应腔个数进行统计。通过荧光成像系统统计发出荧光的反应腔数量，并利用泊松分布进行分析，就可以得到原始PCR预混液中的靶基因含量。

现有的芯片式数字PCR检测仪器结构复杂，仪器成本高。同时，芯片的封装结构复杂，这导致热响应速度的降低，热循环所需时间延长，一次检测的时间可达2小时。

发明内容