[发明专利]一种微菌素J25重组整合工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种微菌素J25重组整合工程菌，其特征在于：该微菌素J25重组整合工程菌是以大肠杆菌MG1655为基础菌株，在该基础菌株的基因组araB处进行微菌素J25同源重组整合，其中，重组整合后微菌素J25重组整合工程菌中基因组araB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的微菌素J25重组整合工程菌的构建方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)参考NCBI基因库中微菌素J25全基因序列，先将微菌素J25基因A、B、C、D表达方向调整一致，并在基因A前插入大肠杆菌组成型启动子基因，得到调整后的微菌素J25全基因序列，并将该序列整合进载体上；

(2)以步骤(1)构建成功的载体为模板，用引物25扩增出带有微菌素J25基因的片段一；再以MG1655基因组为模板，分别用上臂引物和下臂引物扩增出带有araB基因的片段二和片段三；然后以片段一、片段二、片段三为模板，以上臂引物的上游引物和下臂引物的下游引物为引物，扩增出带有MG1655 araB基因同源臂的微菌素J25修复片段；

(3)通过融合PCR扩增，得到sgRNA片段；将sgRNA片段与T载体无缝连接，得到带有sgRNA的质粒DsgRNA；

(4)将pCas9质粒转入大肠杆菌MG1655，并制成感受态；然后将带有MG1655 araB基因同源臂的微菌素J25修复片段和DsgRNA质粒同时转入制备好的感受态并鉴定，得到正确重组的克隆菌；

(5)把步骤(4)正确重组的克隆菌在无抗生素的培养基中连续传代筛选质粒丢失的菌株，得到微菌素J25重组整合工程菌。

3.根据权利要求2所述的微菌素J25重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的调整后的微菌素J25全基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求2所述的微菌素J25重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的带有MG1655 araB基因同源臂的微菌素J25修复片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求2所述的微菌素J25重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的载体为pet28a(+)载体。

6.根据权利要求2所述的微菌素J25重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的引物25、上臂引物和下臂引物的核苷酸序列如下所示：

25-F：5’-gaataaccagttccgtcatcttgacagctagctcagtc-3’；

25-R：5’-cacagctcaatccacgatgc ttattcagtaacagaagccag-3’；

上臂-F：5’-gaaacccgtattggcaaatattgacggccagttaagccattc-3’；

上臂-R：5’-ctaggactgagctagctgtcaagatgacggaactggttattc-3’；

下臂-F：5’-gcatcgtggattgagctgtgcgactgggtgccagctctgc-3’；

下臂-R：5’-gtgccatcacgttattaacggcgatcccctgatcggtaaag-3’。

7.根据权利要求2所述的微菌素J25重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的融合PCR扩增的引物为：

SgRNA-F：

5’-ccctgatggctagctcagtcctagggattatgctagccgaacgcgatgttcgtattggttttagagctagaaatagcaagtta-3’；

SgRNA-R：5’-gcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctc-3’。